以聚乙二醇水凝胶膜为载体构建的角膜上皮移植片对LSCD治疗的可行性

目的探讨聚乙二醇水凝胶膜(PHFs)是否能作为角膜上皮细胞(CECs)体外扩增的载体以及其能否用于角膜缘干细胞缺乏症(LSCD)的治疗。方法利用癸二酰氯、聚氧乙基甘油醚、聚已酸内酯二醇人工合成PHFs,检测其厚度、透光度和机械拉伸性能。取清洁级新西兰大白兔4只,培养原代角膜缘上皮细胞,荧光显微镜下观察培养细胞中角蛋白标志物AE1/AE3和干细胞标志物p63的表达;将细胞分为阴性对照组、阳性对照组和PHFs+CECs组,其中将阴性对照组细胞直接种植在培养皿底,加入普通细胞培养液,将阳性对照组细胞种植在培养皿后加入含有100μmol/L H_(2)O_(2)的普通细胞培养液,将PHF+CECs组细胞种植在铺有PHFs的培养皿中用普通细胞培养液培养,各组培养24 h。采用MTT和TUNEL染色法分别观察3个组细胞增生和细胞凋亡情况。采用随机数字表法将清洁级新西兰大白兔15只分为对照组、PHFs组和PHFs+CECs组,每组5只。其中对照组造模后不给予任何处置;PHFs组将空PHFs膜置于LSCD实验兔角膜表面;PHFs+CECs组为将CECs传代后种植于PHFs上构建组织工程移植片后将移植片置于LSCD兔模型的角膜表面。采用荧光素染色法检测各组实验兔角膜缺损面积大小并评分;采用苏木精-伊红染色法检测各组实验兔角膜上皮组织学特点。结果PHFs厚度不超过150μm,能承受约6 MPa的拉力,在400~700 nm可见光范围内透过率>99%。角膜缘原代培养的大多数细胞AE1/AE3染色和p63染色阳性。MTT实验结果显示,PHFs+CECs组、阴性对照组和阳性对照组A_(490)值分别为0.59±0.01、0.65±0.07和0.06±0.04,总体比较差异有统计学意义(F=12.25,P<0.05),其中PHFs+CECs组和阴性对照组A_(490)值明显大于阳性对照组,差异有统计学意义(均P<0.05)。TUNEL检测结果显示,PHFs+CECs组、阴性对照组和阳性对照组TUNEL阳性细胞率总体比较差异有统计学意义(F=13.45,P<0.05),其中PHFs+CECs组和阴性对照组TUNEL阳性细胞率明显低于阳性对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。荧光素染色结果显示,随着术后时间的延长,各组角膜荧光素钠染色评分均降低,对照组、PHFs组和PHFs+CECs组角膜荧光素钠染色评分依次降低。苏木精-伊红染色结果显示,对照组存在较少形状不规则的角膜上皮细胞,PHFs组一些区域出现单层稀疏的角膜上皮细胞;PHFs+CECs组角膜上皮覆盖范围最大,细胞层数增加到3~5层,形态较规则,排列较紧密。结论PHFs韧性强、透光度高且能够体外扩增角膜上皮,适合做角膜上皮移植片,并能促进LSCD兔模型角膜上皮的修复。