新型免疫抑制剂FK520的功能研究

探讨新型药物FK520的免疫抑制功能。以ConA非特异性多克隆活化淋巴细胞,研究FK520对该增殖的免疫抑制效应;用尼龙毛柱分离OVA(卵清蛋白)TCR转基因小鼠T淋巴细胞后,以OVA323-339肽致敏的抗原提呈细胞刺激该T淋巴细胞增殖,研究FK520对抗原特异性T淋巴细胞增殖的免疫抑制效应;将20只5周龄NOD小鼠随机分为两组,每周分别给NOD小鼠肌肉注射FK520或溶剂2次,每次给予FK520药物10 mg/kg或相同体积溶剂,观察FK520对NOD小鼠体重、血糖及胰岛炎的影响。结果显示,FK520体外不仅能显著抑制淋巴细胞非特异性多克隆活化增殖,而且能抑制抗原特异性T淋巴细胞增殖,该免疫抑制效应具有量效依赖关系。体内注射FK520能显著降低NOD小鼠IDDM发病率(P<0.05),推迟小鼠IDDM的发生。上述结果表明,FK520具有显著的免疫抑制效应和潜在对自身免疫性疾病的治疗作用。

柯萨奇病毒B3型诱导的免疫偏离与心肌炎发病关系的研究

目的研究2种近交系小鼠在柯萨奇病毒B3型(CVB3)感染后辅助性T细胞(Th)免疫偏离对心肌炎发病的影响。方法用CVB3腹腔感染BALB/c和C57BL/62种近交系小鼠,感染后7d通过检测小鼠血清肌酸激酶(CK)活性,观察心脏外观变化以及心脏石蜡切片H.E染色观察心脏病理改变,比较2种小鼠心肌炎的发病情况;通过体外感染心肌细胞观察病毒复制情况以及体内心脏组织病毒载量的分析,比较2种小鼠对病毒感染和复制的差异;通过检测感染小鼠细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、IL-12和γ干扰素(IFN-γ)的表达,抗CVB3VP1抗体的亚型以及T-bet和Gata-3的表达,比较2种小鼠Th免疫偏离的情况。结果CVB3在体外和体内都可以感染BALB/c和C57BL/6小鼠心肌细胞,但仅BALB/c小鼠感染后可发生明显的病毒性心肌炎,C57BL/6小鼠则不能;BALB/c小鼠感染后表现为Th1型免疫反应而C57BL/6小鼠则偏向于Th2型免疫反应。结论CVB3感染2种品系小鼠表现为不同的心肌炎发生率,与其诱导了不同类型的免疫偏离密切相关。

基于基因免疫制备抗人绒毛膜促性腺激素β亚基单克隆抗体及其特性研究

用真核表达人绒毛膜促性腺激素β亚基((human chorionic gonadotrophinβ,hCGβ)的重组质TR421-hCGβ免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,ELISA法筛选阳性细胞株,经过多次的克隆化培养,最终获得10株持续、稳定分泌抗hCGβ单克隆抗体的杂交瘤细胞株。随机抽取6H1杂交瘤细胞进行抗体的制备、纯化及免疫学特性的分析。间接ELISA法证明6H1单抗属于IgG2a亚类。Western blot证明6H1单克隆抗体可以特异性结合hCGβ,间接免疫荧光和流式细胞仪等结果表明,6H1单克隆抗体能够不同程度的结合不同来源的肿瘤细胞膜上表达的hCGβ分子,为进一步研究其生物学功能奠定了物质基础。

小鼠骨髓瘤细胞分泌的免疫球蛋白对其自身增殖作用的体外研究

为了研究小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8所分泌的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)对其自身增殖的影响,首先用ELISA方法检测P3X63Ag8细胞培养上清中的Ig含量;而后以不同浓度的P3X63Ag8细胞培养上清作用于P3X63Ag8细胞,通过3H-TdR掺入和MTT比色法检测细胞增殖水平,并比较P3X63Ag8细胞与其他肿瘤细胞对该培养上清的反应性;最后以抗小鼠IgG抗体中和P3X63Ag8细胞分泌的Ig,观察其对细胞增殖的影响。结果显示,P3X63Ag8细胞分泌小鼠IgG;不同浓度的P3X63Ag8细胞培养上清均可促进细胞增殖,并具有一定的剂量依赖性;与P3X63Ag8细胞不同,小鼠乳腺癌细胞系4T1的增殖不受P3X63Ag8细胞培养上清的影响;以抗小鼠IgG抗体中和P3X63Ag8细胞分泌的Ig,可部分抑制P3X63Ag8细胞增殖。该结果表明,小鼠骨髓瘤细胞分泌的Ig可能具有促进骨髓瘤细胞增殖的能力,这为我们更加深入理解多发性骨髓瘤的发病机制提供了一定的实验依据。

肝素抑制T细胞活化及机制研究

目的:长期临床实践及动物实验研究发现肝素具有一定抗炎作用,本文旨在阐明其机制是否与抑制T细胞活化过程,以及影响T细胞与抗原递呈细胞间的免疫突触的形成有关。方法:本研究通过氚掺入法检测肝素对T细胞活化增殖的影响,包括丝裂原ConA,超抗原SEA作为刺激剂,此外还有特异性抗原肽;加入外源性IL-2检测肝素抑制T细胞活化与IL-2作用的关系。流式细胞术检测T细胞活化表面标志CD62L的变化;肝素干预下T细胞与抗原递呈细胞间的相互作用,以及T细胞肌动蛋白的聚集情况。结果:在肝素干预下,ConA活化T细胞增殖明显降低并体现出剂量依赖关系,另外SEA、混合淋巴细胞反应以及特异性抗原肽刺激T细胞的增殖也不同程度受到肝素的抑制,外源性IL-2不能挽救被抑制的T细胞。流式细胞检测结果提示肝素干预组T细胞上CD62L表达明显高于对照组。肝素不影响T细胞与抗原递呈细胞之间的作用,也不影响T细胞骨架重排,即免疫突触的形成。结论:肝素抑制T细胞活化及增殖,可能是其抗炎机制的一部分,但并非通过影响T细胞与抗原递呈细胞之间的作用或T细胞活化过程中骨架重排及突触形成。

抗病毒固有免疫分子TRIM22 C端SPRY结构域对其转录、翻译及亚细胞定位的影响

本文旨在探讨TRIM22 C端SRPY结构域对其转录、翻译及亚细胞定位的影响。以野生型TRIM22真核表达质粒为模板,扩增出C端SPRY结构域缺失的TRIM22基因片段,并将其克隆入真核表达质粒pcDNA3.1。将野生型和突变型TRIM22真核表达载体分别转染高分化人肝癌细胞株HepG2。通过反转录-聚合酶链反应检测其mRNA表达水平,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测其蛋白表达水平,并通过间接免疫荧光法检测其亚细胞内定位。结果成功构建了C端SPRY结构域缺失的TRIM22真核表达质粒。转染HepG2细胞后,TRIM22 SPRY结构域缺失突变体在转录和翻译水平上均与野生型TRIM22无明显差异,但TRIM22 SPRY结构域缺失突变体完全丧失了核定位能力,这为进一步研究SPRY结构域在TRIM22抗病毒过程中所发挥的作用及机制提供了有益的启示。

固有免疫分子TRIM5α对乙型肝炎病毒复制的影响

目的:构建固有免疫分子TRIM5α的真核表达质粒,研究TRIM5α对HBV复制的影响。方法:通过巢氏RT-PCR技术从恒河猴肺组织中扩增出TRIM5α的编码基因,并将其克隆入pcDNA3.1真核表达载体。将TRIM5α真核表达质粒转染HepG2细胞,用Western blot的方法鉴定TRIM5α蛋白表达情况。将TRIM5α真核表达质粒与复制型HBV质粒通过磷酸钙沉淀法共转染HepG2细胞、通过尾静脉高压注射法共转染BALB/c小鼠。ELISA检测转染细胞上清及小鼠血清中的HBsAg和HBeAg;免疫组化检测小鼠肝组织HBcAg的表达;Southern blot检测转染细胞中HBV复制中间体。将TRIM5α真核表达质粒转染293T细胞3小时后,再将基于HIV-1结构的慢病毒载体三质粒系统转染293T细胞,通过检测转染细胞上清中的HIV-1 p24抗原含量来鉴定TRIM5α抗HIV-1功能。结果:成功构建TRIM5α真核表达质粒;过表达TRIM5α不能有效降低HBV抗原和复制中间体水平,但可抑制HIV-1 p24抗原的表达。结论:TRIM5α不能有效抑制HBV的复制。

磷酸酶SHIP-1对T细胞分化、稳态和免疫应答的调控效应

T细胞是适应性免疫应答的重要调控者,对其发育、分化及稳态的调节一直是免疫学领域的研究重点和热点。含有SH2结构的5'肌醇磷酸酶-1(SH2-containing inositol phosphatase-1,SHIP-1)能够水解磷脂酰肌醇-3激酶(phosphafidylinositol 3-kinase,Pb3K)信号途径中的关键物质磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol3,4,5-triphosphate,PIP_3),从而参与T细胞免疫应答。SHIP-1对T细胞发育、分化及免疫稳态发挥重要调控作用,本文就SHIP-1对T细胞的分化和稳态的免疫调控作用及其机制的研究进展作一简要综述。

肿瘤免疫中的记忆性T细胞

肿瘤免疫的长期性和T细胞的异质性决定了记忆性T细胞在肿瘤发生发展中的重要地位。近年来对肿瘤免疫中记忆性T细胞产生、分类、维持机制和功能方面的研究也取得了重大进展,这不但丰富了免疫记忆理论,也为肿瘤的防治提供了重要的理论依据和实验指导。

淋巴细胞趋化因子增强柯萨奇病毒DNA疫苗黏膜免疫及预防小鼠心肌炎的作用

本研究在已建立的柯萨奇病毒B3型(CVB3)黏膜疫苗chitosan-pVP1基础上,引入C家族趋化因子,即淋巴细胞趋化因子(LTN),以期诱导更强的黏膜免疫应答,获得更有效的免疫保护作用。将pLTN与pVP1各50μg混合后,与chitosan形成共聚复合物,隔周滴鼻免疫小鼠,共4次;末次免疫后2周,检测血清IgG、粪便IgA及肠系膜淋巴结细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。同时,以3LD50/0.1mlCVB3腹腔感染小鼠,7d后检测血清肌酸激酶(CK)活性及心肌病理学改变。结果显示,与对照组相比,chi-(pVP1+pLTN)可显著提高CVB3特异性血清IgG水平、粪便IgA水平以及增强肠系膜淋巴结特异性CTL应答。病毒攻击后,chi-(pVP1+pLTN)组心肌炎发病率仅为16.7%,显著低于chi-(pVP1+pcDNA3.1)组的33.3%。心肌组织病理显示,chi-(pVP1+pLTN)组心外膜下仅有轻微炎症,而chi-(pVP1+pcDNA3.1)组除心外膜下有较多淋巴细胞聚集外,心肌内尚有少量炎症浸润和坏死灶。结果提示,LTN与VP1质粒经chitosan共包装后进行滴鼻免疫,可增强CVB3特异性黏膜免疫应答,更有效地预防病毒性心肌炎的发生。

人用禽流感疫苗研究渐入佳境

由高致病性禽流感病毒导致的人流行性感冒（简称流感）发病和死亡迄今仍严重危害人类健康和公共卫生安全。据世界卫生组织（WHO）报道，自2003年12月-2006年7月，全球共报告131例死于禽流感；我国已累计报告人感染高致病性禽流感病例19例，死亡12例，报告病例的省份11个。对于人禽流感，目前尚无有效的特异性预防手段，而高致病性禽流感病毒一旦突破人群免疫屏障，演变为人-人间可传播的高致病性流感病毒，将造成大量的感染和死亡病例。进行有效的疫苗接种是迅速建立人群免疫屏障，阻断流感大流行的蔓延，减少和降低其危害的有效手段。为此，世界各国迅速开展了禽流感疫苗的研制，特别是人用禽流感预防性疫苗的研制。

微小RNAs与αβT细胞发育和功能的研究进展

近年来的研究显示,微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)在机体免疫细胞发育和免疫应答中发挥了重要作用,尤其是miRNAs在αβT细胞的发育、活化、功能亚群分化和老化等一系列生物学过程中发挥了关键的调控作用。这些研究进展不仅对于深入认识机体免疫系统和应答机制,还对于相关临床疾病的治疗具有重要意义。

一株抗双链DNA单克隆抗体的制备及其特性研究

制备抗双链DNA（dsDNA）单克隆抗体并对其生物学特性进行初步研究.以活化淋巴细胞的DNA为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体;用体内诱生法制备腹水,以间接酶链反应吸附试验（ELISA）法分析抗体的亚类、特异性和亲和力;用免疫荧光法检测抗体的荧光核型;用考马斯亮蓝法检测注入杂交瘤细胞的小鼠的尿蛋白含量.结果显示,成功获得了1株持续稳定分泌抗dsDNA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为6C2;该细胞株所分泌的抗体亚类为小鼠IgG2a,能特异性结合dsDNA,亲和力常数为2.67×10^8 mol/L,免疫荧光核型为均质型;将6C2细胞注入正常BALB/c小鼠腹腔后,小鼠的尿蛋白含量较对照组明显增高.结果表明,抗dsDNA单克隆抗体6C2是致病性抗体,对于进一步研究抗dsDNA抗体的致病机制具有重要的价值.

CVB3感染对固有免疫识别受体MDA-5表达的影响及其意义

目的研究柯萨奇B3病毒(coxsackievirus group B type3,CVB3)感染对固有免疫识别受体—黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene-5,MDA-5)表达的影响及其意义。方法采用RT-PCR扩增CVB3正负链以确证感染成功,CVB3感染正常HeLa细胞后用RT-PCR的方法检测MDA-5和IFN-β的表达变化,RT-PCR检测CVB3感染IFN-α处理过细胞MDA-5的表达情况,将细胞分为对照组(转染空载体)和MDA-5组(转染MDA-5表达质粒pEF-BOS-MDA-5),将空载体或pEF-BOS-MDA-5质粒与IFN-β启动子荧光报告质粒和作为内参照的pc MV-lacZ质粒瞬时转染进两组细胞,CVB3感染8h后收集细胞检测IFN-β启动子活性变化。结果与未感染组相比,CVB3感染下调固有免疫识别受体MDA-5及IFN-β的表达;IFN-α可明显上调MDA-5的表达,而CVB3感染抑制IFN-α的这种上调作用;CVB3感染下调MDA-5介导的IFN-β启动子的活化。结论CVB3感染能下调固有免疫识别受体MDA-5的表达并抑制MDA-5对IFN-β启动子的活化,从而下调IFN-β的表达,这可能是病毒性心肌炎中病毒逃逸机体免疫应答的机制之一。

M1和M2型巨噬细胞表型的比较分析

通过对M1和M2型巨噬细胞表型相关指标的比较分析,评价各鉴定巨噬细胞类型的表型指标及其意义。按常规方法以IFN-γ及LPS将骨髓来源巨噬细胞诱导成M1型巨噬细胞,以IL-4诱导出M2型巨噬细胞。分别以RT-PCR和酶活性定量方法检测精氨酸代谢相关酶的表达和活性;以ELISA检测IL-12和IL-10的分泌;以FACS检测巨噬细胞膜分子的表达。结果显示:M1型巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达和活性水平较未刺激组明显升高,IL-12产生显著增加,CD16/32表达上调;而M2型巨噬细胞I型精氨酸酶(arginase 1,Arg-1)的表达水平和酶活性较未刺激巨噬细胞显著提高,IL-10分泌轻度增加,并且表达高水平的CD206和DECTIN-1。表型比较分析结果表明,iN-OS表达和活性、IL-12的分泌和膜蛋白CD16/32可用于鉴定M1型巨噬细胞,而Arg-1、CD206和DECTIN-1是鉴定M2型巨噬细胞较为理想的表型指标。

TLR在小鼠胸腺中的表达及其在胸腺细胞发育中的可能作用

检测体外培养和体内发育过程中,胎鼠胸腺处于不同发育阶段时Toll样受体(TLR)的表达,阐明TLR表达量与胸腺细胞发育相关性,为TLR和胸腺细胞发育分化相关研究提供基础数据。无菌取15d胎龄胎鼠胸腺进行体外培养(FTOC),在培养不同时间点(2d,4d,6d),检测处于不同发育期胸腺TLR的表达;同时在孕期不同天数(15~19d),分别取胎鼠胸腺,检测在体内发育过程中胸腺TLR的表达;在FTOC中加入二脱氧鸟苷培养6d以制备胸腺基质细胞,检测基质细胞与胸腺细胞TLR表达情况。结果:小鼠胸腺中检测到多种TLR。FTOC培养中:培养第2天(F2)开始检测到各种TLR,到培养第6天(F6),TLR1,TLR3,TLR6,TLR7,TLR8明显上调,而TLR4,TLR5保持低水平,TLR4在培养第6天又下降;体内发育过程中:TLR6表达量随胎龄增加有较明显上调,TLR1,TLR3-8保持低水平表达;TLR2,TLR9体内体外都未检测到明显表达。在对胸腺细胞与基质细胞TLR表达比较中发现TLR1,TLR5,TLR6,TLR7高表达于胸腺细胞。胎鼠胸腺表达某些TLR,并且在发育不同阶段表达量有所改变,提示TLR可能参与胸...

基于表位多肽的抗TRIM22抗体的制备及其初步应用

目的制备抗TRIM22多肽抗体及鉴定其性能。方法将TRIM22 N端15个氨基酸的多肽(MDFSVKVDIEKEVTC)与钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰白兔制备抗血清;将TRIM22多肽与Affi-Gel 10偶联制备免疫亲和层析柱,兔抗血清经亲和层析纯化后得到TRIM22多肽特异性抗体;采用ELISA测定抗体效价、Western blot鉴定抗体特异性,并利用该抗体通过间接免疫荧光实验来检测TRIM22蛋白的细胞内定位。结果获得了抗TRIM22特异性抗体。Western blot结果显示该抗体能特异识别真核及原核表达的TRIM22蛋白。利用该抗体进行的间接免疫荧光实验发现TRIM22蛋白主要定位在HepG2细胞核中。结论该抗体的制备为TRIM22分子的功能研究提供了有力的工具。

CD4^+CD25^+CCR6^+调节性T细胞在小鼠乳腺癌模型中对CD8^+T细胞的抑制作用

目的:观察CD4+CD25+CCR6+调节性T细胞(简称CCR6+Tregs)体内对CD8+T细胞功能的抑制作用,并探讨其与肿瘤免疫逃逸的关系。方法:建立4T1乳腺癌细胞荷瘤裸鼠模型,FACS分选CCR6+Tregs,检测其Foxp3的表达;FACS分选4T1特异性CD8+T细胞,CFSE标记后分别与CCR6+Tregs或CCR6-Tregs共同过继转输入4T1荷瘤裸鼠体内,观察荷瘤裸鼠肿瘤生长情况和小鼠存活时间;FACS检测肿瘤组织中CD8+T细胞的增殖、细胞因子IFN-γ的产生和颗粒酶B的表达情况。结果:CCR6+Tregs和CCR6-Tregs均高表达Foxp3;CCR6+Tregs和CD8+T细胞共转输组4T1荷瘤裸鼠肿瘤的生长明显快于CCR6-Tregs共转输组和CD8+T细胞单转输组,同时该组荷瘤裸鼠生存时间也明显缩短(P<0.05);CCR6+Tregs和CD8+T细胞共转输组CD8+T细胞的增殖、IFN-γ的产生和颗粒酶B的表达均明显低于CCR6-Tregs共转输组和CD8+T细胞单转输组(P<0.05)。结论:CCR6+Tregs在体内可以有效抑制CD8+T细胞的功能,其在肿瘤免疫逃逸和肿瘤发生、发展中发挥重要作用。

不同凋亡水平T细胞来源的ALD-DNA对抗双链DNA抗体产生的影响

研究不同凋亡水平T细胞来源的ALD-DNA(activated lymphocyte-derived DNA)对抗双链DNA抗体产生的影响。用尼龙毛柱法分离小鼠脾脏T细胞,分别提取不同凋亡水平T细胞的DNA定义为未凋亡ALD-DNA、低凋亡水平ALD-DNA、中凋亡水平ALD-DNA和高凋亡水平ALD-DNA,并免疫同系BALB/c小鼠;用ELISA方法检测血清中IgG类抗双链DNA抗体的水平及其亚型;用考马斯亮蓝法检测免疫小鼠尿蛋白的含量。结果显示,ALD-DNA的凋亡水平与其诱导产生的抗双链DNA抗体水平成正相关,二者的相关系数r=0.852;不同凋亡水平的ALD-DNA诱导的抗双链DNA抗体均以IgG1为主,但IgG2a和IgG2b的水平在高凋亡ALD-DNA免疫组有明显增高;低凋亡ALD-DNA、中凋亡ALD-DNA和高凋亡ALD-DNA免疫小鼠均有显著蛋白尿形成,并且高凋亡ALD-DNA免疫组的尿蛋白含量有明显增高。该结果表明,高凋亡水平的ALD-DNA免疫同系小鼠更易诱导高水平的致病性IgG类抗双链DNA抗体产生,凋亡DNA可能在系统性红斑狼疮(SLE)发生发展过程中发挥了重要作用,这为我们能更加深入的理解SLE的发生机制提供了有力的实验依据。

结核分枝杆菌对巨噬细胞抗原呈递功能的抑制作用

本文旨在通过观察结核分枝杆菌刺激后巨噬细胞抗原呈递功能的变化,探讨结核分枝杆菌的免疫逃逸机制。在体外,结核分枝杆菌刺激巨噬细胞24h后,用流式细胞仪检测γ干扰素(IFN-γ)诱导的主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子、CD86和CD80的表达变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测巨噬细胞的抗原呈递功能;反转录-聚合酶链反应检测巨噬细胞CⅡTA及其启动子PⅠ、PⅢ和PⅣ的mRNA水平。结果发现,结核分枝杆菌抑制IFN-γ诱导的巨噬细胞表面MHCⅡ类分子和CD86的表达,且呈剂量依赖性,但CD80的表达变化不明显;抗原呈递功能明显降低;结核分枝杆菌刺激后巨噬细胞CⅡTA及其启动子PⅠ、PⅢ和PⅣ的mRNA水平显著降低。提示结核分枝杆菌可能通过降低CⅡTA及其启动子PⅠ、PⅢ和PⅣ的mRNA水平,抑制IFN-γ诱导的巨噬细胞MHCⅡ类分子的表达;结核分枝杆菌可降低巨噬细胞CD86的表达,抑制IFN-γ诱导的巨噬细胞抗原呈递功能。