三级生物安全实验室感染性废弃物处理相关问题的探讨

在生物安全管理的各环节中,感染性废弃物的处理是控制实验室生物安全的关键环节。为此,我国制定了关于感染性废弃物处理的法律、法规,以避免污染实验室或环境。本三级生物安全实验室运行的3年中,在处理感染性废弃物时遇到了若干需要认真对待的细节,如固体感染性废弃物处理过程中的灭菌环节、消毒剂使用对压力蒸汽灭菌器的损伤、液体感染性废弃物的灭菌模式等,并提出了解决措施和建议。

上海2009甲型H1N1流行性感冒病毒全基因组分析

2009年全球暴发2009甲型H1N1流行性感冒(简称流感)疫情,上海于2009年5月出现第1例输入型病例。为了解上海地区输入型2009甲型H1N1流感病毒的生物学特征,以上海较早发现的2例输入型甲型H1N1流感患者作为研究对象,分离出A/Shanghai/37T/2009和A/Shanghai/71T/2009病毒,利用实时定量荧光反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定病毒,通过扫描透射电子显微镜观察、免疫荧光检测、全基因组测序和生物信息软件分析,对这2株流感病毒形态、结构、耐药性、基因特点和病毒型别等进行研究。结果显示,病毒呈现正黏病毒颗粒形态特征;犬肾(MDCK)细胞内的病毒能与患者恢复期血清反应。此2株病毒的全基因核酸序列和氨基酸序列与美国参考株A/California/04/2009(H1N1)有较高同源性,其中第31位氨基酸残基发生改变。对金刚烷胺耐药,而对奥司他韦敏感。基于全基因组的系统发育分析,确认此2株病毒属2009甲型H1N1流感病毒。

走近医学真菌

真菌学科所研究的真菌至少包括50000种，其中多数在自然界有机物循环中起重要作用。在医学真菌中，真菌的次级代谢产物如抗生素以及免疫抑制药物如环孢素，均已被用于医疗。此外，酵母已作为一种模式生物进行基因组学、蛋白质组学、代谢组学的研究对象，例如目前研究蛋白质一蛋白质相互作用中，酵母双杂交体系对推动生命科学卓有贡献。与人类疾病密切相关的真菌种类仅为几十种。

可变数目串联重复序列在上海崇明岛地区结核分枝杆菌北京基因型菌株微进化研究中的应用

本文通过对上海市疾病预防控制中心收集并保存的、来源于上海崇明岛地区痰培养阳性肺结核患者的135株结核分枝杆菌北京基因型菌株进行可变数目串联重复序列(VNTR)和单核苷酸多态性(SNP)基因分型,并构建最小生成树(MST),来寻找适合研究北京基因型菌株微进化的VNTR组合及区分不同亚型的分子标志。结果显示,16位点VNTR与SNP的分型结果最匹配,适合于研究该地区北京基因型菌株的微进化;SNP单倍型主要集中在ST10(42.2%)、ST19(30.4%)、ST22(14.1%)3个类型;4个VNTR位点(Mtub21、QUB26、MIRU16和QUB4156)可能是区分北京基因型菌株不同亚型的分子标志。

剖析乙肝病毒的包膜——乙肝表面抗原的生物学功能及其致病机制

乙肝表面抗原作为病毒的包膜蛋白,在病人体内大量存在,甚至远远超过成熟病毒颗粒的含量。这表明表面抗原在乙肝病毒感染过程中具有特殊的作用,在乙型肝炎发病机制中扮演了重要的角色。笔者介绍了乙肝表面抗原在乙肝持续性感染致病机制方面的最新研究进展。

利用鸭乙型肝炎病毒感染模型评价血液成分中病毒的灭活效果

目的利用鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染动物模型,评价亚甲蓝光化学病毒灭活方法对血液成分中DNA病毒的灭活效果。方法将超离纯化的DHBV分别加入人血浆或人红细胞,经亚甲蓝光化学灭活病毒,将含不同基因组拷贝数DHBV的血浆成分经静脉感染1 d龄雏鸭。采用放射性核素核酸杂交法对血清中DHBV DNA进行检测,计算病毒灭活处理前、后人血浆及人红细胞中DHBV的半数感染计量(ID50)。结果结果显示加入DHBV的血浆在未经灭活处理前对1 d龄雏鸭的ID50值为103.33,而经病毒灭活处理后ID50值为1010拷贝,灭活处理可使病毒感染性滴度下降达6个Log;加入DHBV的红细胞灭活前ID50值为103.35,经灭活处理后ID50值为108.35拷贝,灭活处理使病毒感染性滴度下降5个Log。结论利用DHBV感染动物模型,可以检测到少量病毒在自然感染宿主体内的感染性,可用于评判血液成分中病毒灭活方法的效果,亚甲蓝光化学处理对血浆中DNA病毒的灭活效果较好于对红细胞中DNA病毒的灭活作用。

抗乙型肝炎病毒单克隆抗体药物的临床前药效学评价

由乙型肝炎病毒(HBV)感染导致的病毒性肝炎是世界范围内的一个重大公共卫生问题,抗HBV抗体药物乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)是阻断乙型肝炎母婴传播和移植性感染的主要用药。但HBIG本身存在一些问题,而重组抗HBV单克隆抗体能成为其有效替代物。在重组抗HBV抗体技术相对成熟的情况下,重组抗HBV单克隆抗体药物功能性评价体系的缺失成为阻碍抗HBV单克隆抗体药物研发的重要因素。本文就现有的抗HBV单克隆抗体药物的评价方法和体系进行综述。

鸭乙型肝炎病毒核心抗原DNA疫苗的构建及其诱导的体液免疫应答

为研究鸭乙型肝炎病毒核心抗原(DHBcAg)真核表达质粒的免疫原性,分析DHBcAgDNA疫苗诱导的体液免疫应答,首先借助生物信息学方法对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)Core基因编码的氨基酸序列进行亲疏水性分析,分别构建DHBcAg全基因(E-DHBc263)及去除疏水性序列的DHBcAg片段(E-DHBc180)的真核表达质粒,间接免疫荧光检测结果显示可在COS7细胞内表达。进一步构建原核表达质粒p-DHBc263和p-DHBc180,仅p-DHBc180可表达蛋白,纯化后作为酶联免疫吸附试验(ELISA)包被抗原,用于DHBcAb的检测。分别用E-DHBc263和E-DHBc180免疫小鼠,采用间接ELISA检测DHBcAb。结果显示,E-DHBc180可诱导免疫小鼠产生DHBcAb免疫应答,加强免疫后效价可达1∶100～1∶400。结果提示,E-DHBc180可作为DHBcAgDNA疫苗,在DHBV感染鸭模型中评价其效果。

人类免疫缺陷病毒1型慢性感染者B细胞表型分析及抗反转录病毒治疗的修复作用

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染会造成严重的免疫功能损伤,除引起CD4+T细胞不断耗损和功能损伤外,体液免疫应答也受到损伤。本研究通过检测HIV-1慢性感染者和慢性感染治疗者外周血B细胞数目和亚群比例,以及活化、凋亡和共刺激分子的表达,探讨HIV-1感染者中B细胞损伤及抗反转录病毒治疗(ART)对B细胞损伤的修复作用。结果显示,HIV-1慢性感染者外周血B细胞数目显著低于健康对照组,其中未成熟B细胞、初始B细胞、静息记忆B细胞和浆母细胞显著降低,而组织样记忆B细胞显著增加,ART可恢复初始B细胞和组织样记忆B细胞比例,但不能恢复静息记忆B细胞比例。与健康对照组相比,HIV-1感染者未成熟B细胞、初始B细胞、静息记忆B细胞和组织样记忆B细胞中CD38的表达上调;CD95的表达在所有B细胞亚群中均上调;而Bcl-2在初始B细胞、组织样记忆B细胞和浆母细胞中的表达显著降低;静息记忆B细胞和浆母细胞中PD-1的表达上调;共刺激分子CD40在所有B细胞亚群中的表达降低,而CD70的表达在未成熟B细胞以外的亚群中均显著下调。ART仅能部分修复以上分子的表达。结果表明,HIV-1感染引起B细胞及其亚群比例异常,B细胞表现为过度活化、易凋亡及与T细胞作用受损,ART不能完全修复B细胞损伤,有效的免疫干预策略亟待开发。

乙型肝炎病毒e抗原的生物学功能及血清学转换的免疫学基础

目前在临床乙型肝炎的治疗中,乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)消失及其抗体的出现已成为重要的疗效指标。本文回顾了HBeAg的发现及其生物学和医学意义,对HBeAg与乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的免疫原性进行了比较,阐述了HBeAg血清学转换的免疫学基础,并对出现HBeAg血清学转换的意义作了分析。

从痘苗病毒天坛株看继承与创新

2013年迎来了继续改革与创新的一年。作为我国约5000种科技期刊的一份子，《微生物与感染》该如何继续前进？“温故而知新”，了解过去、继承传统，将为我们探索、创新未来打下坚实的基础。本年度的封面图片为痘苗病毒天坛株的电子显微镜照片。追溯痘苗病毒天坛株的历史，可至1926年。当时天花在全球大为流行，在中国有位约25岁的西北军士兵因患天花住在那时的北平传染病医院。当时民国中央防疫处第三科痘苗股负责人兽医齐长庆到医院取该患者带脓液的痘痂，

Viperin蛋白可通过影响非结构蛋白与脂筏的关联抑制丙型肝炎病毒复制

目前,对丙型肝炎病毒(HCV)感染患者主要采用以Ⅰ型干扰素为主的治疗方案,但干扰素抑制病毒的具体机制仍然不详。本研究通过实时聚合酶链反应(PCR)检测HCV的RNA水平,蛋白免疫印迹法检测HCV非结构蛋白的表达,以及膜飘浮实验检测非结构蛋白与脂筏的关联性,探讨干扰素诱导蛋白Viperin抑制HCV复制的机制。结果显示,在体外HCV亚基因复制子及感染细胞模型中过量表达Viperin可显著降低细胞内HCV非结构蛋白的表达及RNA的水平。膜漂浮实验发现,过量表达的Viperin可通过干扰HCV非结构蛋白NS3、NS5A与细胞内脂筏膜的关联,使其对非离子去污剂敏感。进一步研究发现,与脂筏膜结构组成相关的法尼基合成酶(FPPS)可通过与Viperin相互作用,部分反转Viperin的抗HCV复制效应。以上结果提出一种新的干扰素抗HCV机制,即干扰素诱导蛋白Viperin可通过影响非结构蛋白与脂筏的关联,干扰HCV复制复合体的稳定性,从而抑制HCV复制。

α-Actinin影响丙型肝炎病毒非结构蛋白与脂筏的关联及复制

本文旨在探讨α-actinin参与丙型肝炎病毒(HCV)复制的机制。将α-actinin转染Huh7.5细胞,用JFH1感染,发现过表达α-actinin可显著增加HCVRNA水平及非结构蛋白表达,感染性HCV颗粒也同时增多。膜漂浮实验显示,α-actinin可与HCV非结构蛋白NS5A共定位于脂筏。抑制内源性α-actinin表达,可使复制子细胞内NS5A表达减少,且对非离子去污剂敏感而从脂筏脱落。免疫荧光实验显示,NS5A与内质网标志分子calnexin核周共定位消失。以上结果提示,α-actinin可通过影响非结构蛋白与脂筏的关联而参与HCV RNA的合成,为临床治疗及研制新型抗HCV药物提供理论依据和实验基础。

病毒性肝炎治疗药物前沿研讨会

2007年12月9—13日在美国夏威夷茂易岛召开了HEVDART会议（病毒性肝炎治疗药物前沿研讨会）。到会代表368人，来自25个国家及地区。会议共进行了以下几天议程的报告与讨论：①乙型肝炎及丙型肝炎新模型的研究进展；②乙型肝炎病毒（HBV）及丙型肝炎病毒（HCV）的新诊断；③肝纤维化及肝病的早期诊断与处理；④免疫学与发病机制；⑤新治疗措施；⑥对抗病毒因子的耐药性；⑦人类免疫缺陷病毒（HIV）与其他病毒共感染；⑧对HBV、HCV治疗的药理学及与药物间的相互作用。

乙型肝炎病毒表面抗原抑制TLR2和TLR4的激活

目的研究乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)在乙型肝炎病毒(HBV)逃逸机体天然免疫中的作用。方法用乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA)诱导人单核细胞白血病细胞(THP)-1分化成巨噬样细胞,并与HBsAg共培养作比较,在脂多糖(LPS,TLR4的配体)和Pam3CSK4(TLR1、2的配体)的刺激下,检测细胞上清液中细胞因子白细胞介素10(IL-10)、IL-12的表达及胞内IL-10、IL-12mRNA的含量,并利用免疫荧光法观察核转录因子-kappaB(NF-κB)p65入核和蛋白质印迹法(Western blot)检测IκB-α蛋白降解与胞外信号调节激酶(ERK)蛋白磷酸化水平来判定TLR信号通路活化程度。结果HBsAg的胞外处理能以剂量依赖的方式干扰Pam3CSK4和LPS诱导的IL-10和IL-12的产生,同时HBsAg的存在明显干扰Pam3CSK4和LPS诱导的NF-κB p65入核和IκB-α降解以及ERK蛋白磷酸化水平。结论HBsAg抑制TLR2和TLR4的激活。

以HA2为基础的流感病毒候选疫苗同时与H5N1、H1N1和H3N2亚型毒株产生交叉反应

【目的】探讨以流感病毒(IAV)血凝素蛋白茎部(HA2)保守表位为免疫原来诱导针对不同血清型流感病毒的广谱体液免疫应答。【方法】我们构建了一个重组的IAV疫苗IR30-Fd,由A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)病毒株HA2的30个保守的氨基酸残基(IR30)和一个连在碳端的三聚体基序(foldon,Fd)组成。原核表达该蛋白,圆二色谱和Western Blot验证IR-30-Fd的室间结构之后,分别免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔,并同时免疫IR30多肽为对照,制备血清抗体。然后应用ELISA和Western Blot方法检测抗体的滴度,应用细胞ELISA和Western Blot方法检测抗体与不同的IAV菌株HA2蛋白的交叉反应性。【结果】IR30-Fd能够形成具有α螺旋的三聚体空间结构。用IR30-Fd和IR30免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔后获得了高效价的抗IR30的特异性抗体。鼠抗IR30-Fd抗体能与H3N2和H1N1的HA蛋白反应而鼠抗IR30抗体不能。鼠抗IR30-Fd抗体稀释6 400倍、兔抗IR30-Fd抗体稀释8.2×105倍均可以与H5N1的HA蛋白反应。细胞ELISA表明兔抗IR30-Fd抗体与天然状态下的H5N1和H3N2的HA蛋白的结合亲和力高于兔抗IR30抗体。【结论】本研究结果表明IR30-Fd蛋白能够模拟H5N1 HA2蛋白保守序列的天然三聚体结构,并且能够诱导产生针对H5N1 H1N1和H3N2亚型HA蛋白的广谱交叉反应抗体,为研制通用的流感病毒疫苗提供了结构基础。

T细胞耗竭与慢性病毒感染疾病的研究进展

急性病毒感染常形成有效的抗病毒免疫应答,初始T细胞经历克隆扩增,产生大量的抗原特异性T细胞。这些T细胞有的分化成效应T细胞,分泌细胞因子,在快速清除病毒后绝大多数死亡;存活的T细胞分化为能长期提供保护性免疫的记忆T细胞,当再次遇到同源抗原,能形成有效的抗病毒免疫应答。相比之下,慢性病毒感染导致T细胞的功能逐渐减弱,从而使对病毒感染的控制能力大大降低。持续抗原刺激可能导致T细胞逐步失去效应功能和增殖能力而耗竭,最终影响寄主的抗病毒保护能力。本文就T细胞耗竭特性及保持和促进这种耗竭状态的机制,特别是对在慢性人类免疫缺陷病毒感染中的研究进展进行了综述。

乙型肝炎病毒X蛋白对细胞凋亡的影响存在剂量依赖性

乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)与HBV相关肝细胞肝癌(HCC)的发生和发展密切相关。深入研究HBx在HCC形成中的作用将为探索HBV致癌机制提供重要依据。HBx是多功能蛋白,其对细胞凋亡的影响至今仍存在分歧。许多研究表明,HBx既有促进细胞凋亡又有抑制细胞凋亡的功能,但原因不清楚。本研究中,将表达HBx的质粒短暂转染Huh7和293T细胞,结果发现HBx对细胞凋亡的影响存在剂量依赖效应。转染低剂量HBx表达质粒会抑制细胞凋亡发生,而当转染量达到较高程度(>1μg)时,反而会促进细胞凋亡。本实验初步探索了HBx剂量依赖调节细胞凋亡的作用机制,发现HBx随着表达量的不同会影响核因子κB(NF-κB)的细胞定位。

四环素诱导的丙型肝炎病毒非结构蛋白5B稳定细胞株的构建和检测

丙型肝炎病毒(HCV)感染个体后在宿主细胞内长时间保持低水平复制,与慢性肝炎、肝硬化及肝细胞肝癌的发生密切相关。目前,HCV感染后肝细胞发生转化的具体机制还不清楚。非结构蛋白5B(NS5B)是HCV编码的非结构蛋白之一,具有RNA依赖的RNA聚合酶活性(RdRp),是病毒复制所需的关键酶。除参与病毒复制外,NS5B通过直接与宿主蛋白相互作用影响细胞的正常功能逐渐成为人们关注的焦点。为深入了解NS5B在病毒复制和致病过程中的作用,本研究在肝癌细胞系HepG2细胞中构建了可由四环素诱导(Tet-On)的NS5B稳定细胞株。结果显示,与对照组相比,加入四环素可成功诱导NS5B。加入不同浓度的四环素或经过不同的诱导时间,目的蛋白均能同时被标签抗体和抗NS5B抗体检测。免疫荧光法进一步证实NS5B存在于细胞质内。本研究所构建的NS5B稳定细胞株可用于诸多后续试验,为深入研究NS5B的功能提供了细胞模型。