2009年上海分离的2株猪源甲型H1N1流感病毒

2009年全球暴发猪源甲型H1N1流感病毒疫情，上海地区于5月份诊断第一例输入性病例。本研究从上海地区较早发现的两个输入性甲型H1N1流感病例样本中分离出2株病毒，分别命名为A／Shanghai／37T／2009和A／Shanghai／71T／2009。MDCK细胞培养上清中的病毒通过电镜显示，该病毒的直径大约为60～80nm，具包膜，包膜表面有突起，呈现出正粘病毒颗粒形态特征。免疫荧光检测显示，MDCK细胞内病毒成分能与病人恢复期血清反应。2株病毒的全基因核酸序列和氨基酸序列与美国参考株California04具有高度的同源性；基于全基因的系统发育分析，确认此2株病毒属于2009年在全球暴发流行的新型H1N1甲型流感病毒。在此基础上的进一步研究发现，2株病毒可诱导A549细胞中抗病毒效应基因的表达；经Ⅰ型干扰素预处理的细胞可有效抵抗病毒的感染，提示其潜在的保护作用。综上所述，上海分离的2株病毒和2009年北美暴发的猪源甲型H1N1流感病毒是同源的，并且在病毒的致病性，药物的抗性和抗原性方面没有发生变异。

郑州地区耐多药结核分枝杆菌gyrA和gyrB基因突变特征及对氟喹诺酮类药物耐药研究

目的分析郑州地区耐多药(MDR)结核分枝杆菌(MTB)临床分离株中gyrA和gyrB基因突变特征及其对氟喹诺酮类(FQs)药物耐药的特点。方法收集2015年5月至2016年12月河南省胸科医院收治的256例肺结核患者的痰标本,进行MTB固体罗氏培养、液体分枝杆菌培养,MTB培养阳性者行比例法药物敏感性试验,采用聚合酶链式反应扩增MDR MTB的gyrA和gyrB基因,对扩增产物进行测序和序列比对分析。应用耐药基因判断MDR MTB对FQs药物耐药的敏感性和特异性。结果 256例患者中MTB培养阳性215例,其中非MDR肺结核患者137例,MDR肺结核患者78例。78株MDR MTB临床分离株对氧氟沙星(Ofx)、0.5 mg·L^(-1)莫西沙星(Mfx 0.5)及2.0 mg·L^(-1)莫西沙星(Mfx 2.0)的耐药率分别为55.1%(43/78)、55.1%(43/78)、32.1%(25/78);137株非MDR MTB临床分离株对Ofx、Mfx 0.5及Mfx 2.0的耐药率分别为7.3%(10/137)、5.8%(8/137)、0.7%(1/137);非MDR MTB临床分离株对Ofx、Mfx0.5、Mfx2.0的耐药率显著低于MDR MTB临床分离株(χ~2=61.21、66.73、45.87,P<0.001)。gyrA基因、gyrB基因在Ofx耐药株中的突变率分别为90.7%(39/43)、11.6%(5/45);gyrA基因、gyrB基因在Mfx 0.5耐药株中的突变率分别为88.4%(38/43)、11.6%(5/43);gyrA基因、gyrB基因在Mfx 2.0耐药株中的突变率分别为100.0%(25/25)、12.0%(3/25)。以FQs药物敏感性试验结果为金标准,gyrA基因突变判断MDR MTB对Ofx、Mfx 0.5、Mfx 2.0耐药的敏感性分别为90.7%、88.4%、58.1%,特异性分别为88.6%、85.7%、100.0%,gyrB基因突变判断MDR MTB对Ofx、Mfx 0.5、Mfx 2.0耐药的敏感性分别为62.5%、62.5%、37.5%,特异性分别为45.7%、45.7%、68.6%,检测gyrA基因突变判断MDR MTB对FQs药物耐药的特异性高于gyrB基因突变(χ~2=17.86、15.44、13.92,P<0.001),检测gyrA基因突变判断MDR MTB对Ofx耐药的敏感性高于gyrB基因突变(χ~2=4.53,P<0.05)。结论郑州地区MDR MTB对FQs耐药率较高,耐药的主要原因是gyrA基因突变,最常见的gyrA基因突变位于94位点。

园林植物挥发油成分分析及抗菌活性测定

运用试管稀释法和平板涂布法,测定黄皮,白皮松,香榧,侧柏,龙柏,雪松,圆柏等7种常见园林植物的挥发油对表皮葡萄球菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌及绿脓杆菌的抗菌活性(包括抑菌和杀菌两个方面)。结果显示,所有供试植物挥发油均具有一定的抗菌活性。对金黄色葡萄球菌的抑菌活性为侧柏=龙柏>圆柏>雪松>香榧;对表皮葡萄球菌的抑菌活性为侧柏>圆柏>龙柏=雪松=黄皮>白皮松>香榧;仅圆柏挥发油对大肠杆菌具有抑菌作用,所有供试植物挥发油对绿脓杆菌均无抑菌作用。实验证明,圆柏,侧柏,龙柏,雪松具有较强抗菌活性,是较为理想的城市生态保健型绿化模式的栽培树种。

白介素-4和白介素-13促进人肺成纤维细胞ADAM33基因的表达

目的探讨白介素-4(IL-4)和白介素-13(IL-13)对人肺成纤维细胞ADAM33(a disintegrin and a metal-loproteinase33,ADAM33)mRNA表达的影响。方法以不同浓度的IL-4或/和IL-13刺激培养的人肺成纤维细胞(MRC-5),然后用实时定量反转录多聚酶链反应(real-time RT-PCR)法测定ADAM33mRNA表达的变化。结果人肺成纤维细胞上存在着ADAM33mRNA的表达,当分别以10ng/mL的IL-4或IL-13刺激时,AD-AM33mRNA的表达增加呈现时间依赖性,至24h达到高峰。随着IL-4和IL-13刺激浓度的增加,ADAM33mRNA的表达也明显增加:以100ng/mL的IL-4和100ng/mL的IL-13刺激时,ADAM33mRNA的表达较未刺激细胞分别增加了(9.49±2.83)倍和(14.21±3.35)倍(P<0.01);而以10ng/mL的IL-4和10ng/mL的IL-13联合刺激时,ADAM33mRNA的表达较未刺激细胞增加了(15.06±4.57)倍(P<0.01)。结论IL-4和IL-13能明显促进肺成纤维细胞ADAM33mRNA的表达。

ADAM33基因在慢性哮喘小鼠气道重塑中的表达

目的:研究ADAM33(a disintegrin and a metallo proteinase 33)mRNA在慢性哮喘小鼠模型气道重塑中的表达。方法:20只雌性C57BL/6小鼠随机分为2组,每组10只。A组(慢性哮喘组)分别于第1、14天小鼠腹腔注射1mL致敏液,从第21天开始雾化吸入2.5%的卵蛋白(OVA)溶液,每次30min,每周3次,连续8周。(2)B组(生理盐水对照组)给予生理盐水进行致敏和激发。在末次激发24h后,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)做细胞分类计数。用实时定量反转录多聚酶链反应(real-timeRT-PCR)法测定肺组织中ADAM33、白介素-4(IL-4)和白介素-13(IL-13)mRNA表达量。取左肺组织分别行苏木紫-伊红(HE)染色和Masson′sTrichrome染色,用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体行免疫组化染色。结果:A组BALF中嗜酸粒细胞[(6.3±1.3)×105/mL]及百分比[(18.1±3.0)%)]、肺组织中ADAM33、IL-4和IL-13等mRNA表达量[分别为(1.41±0.93)×10-2、(5.72±3.89)×10-2、(9.45±5.91)×10-2)]与B组相比明显增高(P<0.01)。而且Masson′sTrichrome染色示上皮下胶原纤维沉积增加、α-SMA免疫组化示气道平滑肌层明显增厚。结论:ADAM33 mRNA在小剂量OVA反复激发复制的慢性哮喘小鼠模型中表达增加,可能参与气道重塑的发生和发展。

葡萄糖类似物甲基葡萄糖对表皮葡萄球菌生物被膜形成的影响及调节机制的研究

生物被膜(Biofilm)是条件致病菌表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的主要致病因素,生物被膜的形成依赖多糖PIA的合成,PIA合成与细菌糖代谢相关。通过研究葡萄糖类似物甲基葡萄糖(MethylDglucoside,MG)对生物被膜的形成及相关基因表达的影响,考察生物被膜形成的调控机制并寻找抑制生物被膜形成的方法。甲基葡萄糖能抑制97337株生物被膜的形成,而且不同浓度的甲基葡萄糖对生物膜作用不同。甲基葡萄糖对97337株生物被膜形成的早期的粘附有较强的抑制作用;不同浓度的甲基葡萄糖处理后对ica和AtlE基因的mRNA表达水平影响不大,但能诱导agr基因的表达,这与甲基葡萄糖处理不同时间后的结果一致;而且甲基葡萄糖处理后97337的表面相关蛋白的组成明显改变。甲基葡萄糖对生物膜的抑制并不直接由于它对生长的抑制,它对细菌生长和生物被膜形成的抑制与其在细菌糖代谢中的竞争性相关;甲基葡萄糖能通过调控agr基因的表达改变细菌表面从而抑制97337的早期粘附和生物被膜的形成,但没有通过调控icaADBC、icaR的表达抑制生物膜的形成,可能与其对合成PIA相关糖基转移酶的竞争性抑制相关。

荧光复合扩增DXS6804、DXS6799和DXS7132基因座

应用分子克隆技术制备出DXS6804、DXS6799和DXS7132基因座的等位基因分型标准物，通过研究复合扩增技术，构建3个基因座X—STR复合扩增的荧光检测体系。

上海地区有治疗史患者中结核分枝杆菌耐药菌株的传播

根据耐药产生的原因，理论上可将耐药结核病分为直接感染耐药结核分枝杆菌引起的原发性耐药和结核分枝杆菌菌株的基因组发生突变而产生的获得性耐药，由于结核病的发病特点及结核分枝杆菌菌株的特性，传统方法无法鉴别耐药是否由同一菌株引起，因此目前简单地将原发性耐药定义为未经治疗的患者对某种抗结核药物的耐药，而获得性耐药是既往有结核病治疗史（超过1个月）的耐药结核病。实际上此种获得性耐药包括以下3种情况：

embB306位点作为耐多药结核分枝杆菌分子检测标记初探

目的研究embB基因306位点（embB306）突变在耐多药结核分枝杆菌中的分布，探讨以该位点作为耐多药分子检测标记的应用前景。方法从上海疾病预防控制中心获得其保存的已知耐药表型的结核分枝杆菌291株，使用错配PCR及DNA测序两种方法检测其embB306位点的突变，分析耐药表型与结核分枝杆菌embB306位点的突变的相关性。结果74株耐多药菌株中有38株（51．4％）该位点有突变（X2=93．8，P〈0．01），而其他24株多耐药菌株中有9株（37．5％）为embB306突变株（r=60．1，P〈0．01）；41株耐单药菌株中仅有2株（4．9％）存在该位点的突变（X2=6．8，P=0.0093），而152株全敏感菌株中无一存在该位点突变。以embB306位点作为耐多药结核分枝杆菌（MDR—TB）分子检测标记的特异度达94．9％（206／217）。结论以embB306作为耐药突变位点，特别是耐多药结核分枝杆菌的分子检测标记，具有一定的灵敏度和较高的特异度，而且检测方法简单易行，可用于耐多药结核分枝杆菌的临床快速检测。

原发性耐药是耐药结核病产生的重要原因

目的研究原发性耐药在产生耐药结核病中的作用。方法对上海市疾病预防控制中心收集保存的1996年至2004年结核分枝杆菌临床菌株进行分析统计,计算原发性耐药和获得性耐药的比例;并对16例复发耐药患者前后发病菌株进行结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterialinterspersedrepetitiveunits,MIRU)基因型比较分析。结果在保存的初治患者的8120株结核分枝杆菌中,耐药菌株707株,耐药率为8.7%;复治患者的菌株610株,耐药菌株150株,耐药率为24.6%。初治和复治患者中耐药率均有上升趋势。以初治患者耐药代表原发性耐药,复治患者耐药代表获得性耐药,其原发性耐药占总耐药菌株的82.5%。在16例复发耐药患者中,13例患者在两次发病时分离的菌株基因型不一致,可能是由于重新感染了耐药菌株所致,属于原发性耐药。结论原发性耐药是目前耐药结核病产生的重要原因,该结果提示有效控制结核病的传染源是减少耐药结核病产生的关键。

结核分枝杆菌散在分布重复单位基因型分型法的应用研究

目的建立结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterialinterspersedrepetitiveunits,MIRU)基因型分型法,评估该方法在我国应用的可行性。方法采用简单数字表法随机抽取上海地区2000年至2002年保存的菌株,对其进行MIRU分型,并与间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping)的结果进行比较。结果用Spoligotyping方法对随机抽样的91株临床菌株进行基因型分型,得到20种基因型,其中81株(89%)属于北京基因型菌株,而用MIRU分型方法可将这些菌株分为46种基因型。81株北京基因型菌株可以分为39种不同的MIRU基因型。12个MIRU位点的多态性分析表明各位点有较大的区别,其中位点26显示了较高的多态性,位点16、31、40显示了中等程度的多态性。结论MIRU分型方法简单快速,其数字化结果清晰可靠,是一种有效的结核分枝杆菌基因型分型方法。

异质性耐药对结核分枝杆菌表型和基因型耐药检测结果的影响

目的 研究异质性耐药对MTB基因型耐药检测结果的影响.方法 选择上海市疾病预防控制中心在2009年收集的80株氧氟沙星临床耐药菌株,利用基因测序检测菌株在gyrA和gyrB耐药决定区的基因突变情况,再用分子克隆和荧光定量PCR探针熔解曲线法,分析经基因测序未检测到耐药突变的菌株中是否存在异质性耐药现象.结果 基因测序报告显示,80株氧氟沙星耐药菌株中有15株未发现已知gyrA或gyrB耐药决定区的基因突变.测序图谱及分子克隆和探针熔解曲线法分析结果表明,其中14株菌株含有已知gyrA耐药突变,即存在异质性耐药现象.纳入异质性耐药的菌株后,基因型与表型耐药检测的符合率从81.3％（65/80）提高到98.8％（79/80）.结论 异质性耐药是导致表型和基因型耐药检测结果不符的重要原因.为排除异质性耐药对耐药基因检测的影响,提高基因型与表型耐药检测结果的一致性,需要开发应用更敏感的基因型耐药检测技术,以提高耐药结核病快速检测水平.

利用结核分枝杆菌基因型分型技术研究外源性再感染在结核病复发中的作用

目的研究外源性再感染在结核病复发中的作用。方法以上海地区1999年1月至2004年3月复发肺结核患者为对象,通过比较复发肺结核患者前后两次发病时结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterialinterspersedrepetitiveunits,MIRU)基因型的差异,判断结核病复发的原因。结果在37例符合要求的结核病复发患者中,25例患者两次发病时MIRU基因型发生了变化,提示68%的结核病患者复发是由于外源性再感染而引起的。随着年龄的增加,结核病复发患者中由外源性再感染所致的可能性逐步降低,≤30岁、31～60岁、≥61岁患者中外源性再感染的比例分别为3/3、73%(11/15)、58%(11/19)。随着复发间隔时间的延长,结核病复发患者中由外源性再感染所致的可能性逐步增加,6个月内复发的患者中58%(7/12)是由外源性再感染引起的,而1年以后这个比例达到79%(11/14)。结论外源性再感染是上海地区结核病复发的重要原因;MIRU分型方法是研究结核病复发原因的可行方法。

结核分枝杆菌embB基因306位点突变与耐药的相关性研究

embB基因突变，特别是其306位点（embB306）的点突变一直被认为是结核分枝杆菌耐乙胺丁醇的重要原因。但是，Hazbon等对来自世界各地的1020株菌株进行分析后认为，embB306突变不直接引起结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性，而是容易产生对任何药物的耐药性。Plinke等报道，embB306位点突变只发生在乙胺丁醇耐药菌株中，从而说明该位点突变与乙胺丁醇耐药有关。可见embB306位点突变与乙胺丁醇耐药的关系还存在着较大的分歧。

胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸对慢性支气管哮喘小鼠气道重塑的影响

目的 研究含非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）能否预防或减轻慢性支气管哮喘（简称哮喘）小鼠气道重塑的发生。方法 40只雌性清洁级C57BL／6小鼠按随机数字表法分为4组，每组10只。（1）慢性哮喘组（A组）：分别于第1、14天小鼠腹腔注射1ml致敏液[卵蛋白（OVA，10μg）＋氢氧化铝凝胶（100μg）]；从第21天开始雾化吸入2．5％OVA溶液，每次30min，每周3次，连续8周。（2）CpG—ODN干预组（B组）：在OVA致敏的同时给予浓度为60μg／ml的CpG—ODN腹腔注射1ml共2次，以后每2周腹腔注射1次共4次。（3）GpC—ODN对照组（C组）：将CpG替换为鸟嘌呤-磷酸-胞嘧啶（GpC，剂量及用法同CpG-ODN）作为对照。（4）生理盐水（NS）对照组（D组）：给予NS进行致敏（每次1ml腹腔注射）和激发（用NS雾化吸入）。在末次激发24h后所有小鼠取血测嗜酸粒细胞（EOS）数和血清IgE；收集支气管肺泡灌洗液（BALF）做细胞分类计数，用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测上清液中自细胞介素13（IL-13）和转化生长因子β1（TGF—β1）的浓度。取左肺组织行苏木精-伊红（HE）染色和Masson三色染色，用抗α平滑肌肌动蛋白（α—SMA）抗体和抗TGF—β1抗体行免疫组化染色。结果 A组外周血EOS计数为（89±10）×10^4／ml、血清IgE为（279±53）ng／ml，BALF中EOS计数和分类分别为（6．30±1．30）×10^5／ml、0．181±0．030，A组IL-13浓度为（4015±361）pg／ml、TGF—β1浓度为（356±64）pg／ml，以上数值与D组比较差异有统计学意义（t值分别为24．0、15．7、14．7、18．4、12．0和18．9，P均〈0．01）；A组Masson三色染色、α-SMA、TGF-β1阳性染色面积百分比[分别为（29．7±4．2）％、（45±7）％、（34±4）％]与D组比较差异也有统计学意义（t值分别为18．0、15．6和17．9，P均〈0．01）。应用CpG-ODN干预后（B组）的Masson三色染色、α—SMA、TGF—β1阳性染色面积百分比[分别为（13．8±3．2）％、（25±3）％、（18±4）％]与A组比较差异也有统计学意义（t值分别为9．5、8．9、9．8，P均〈0．05）。结论应用CpG-ODN干预慢性哮喘模型，不仅能抑制Th2细胞反应和EOS肺浸润，还能抑制气道重塑的发生和发展，它可能是通过抑制TGF—β1、IL-13等因子而抑制气道重塑的。

福氏志贺菌喹诺酮类耐药临床分离株gyrA和parC的基因突变

目的检测福氏志贺菌喹诺酮类耐药临床分离株DNA旋转酶gyrA和拓扑异构酶ⅣparC基因的突变情况,探讨GyrA和ParC氨基酸改变与喹诺酮类耐药的相关性。方法根据药敏实验结果选取47株福氏志贺菌临床分离菌,对其gyrA、parC喹诺酮耐药决定区(QRDR)进行聚合酶链反应(PCR)扩增和测序分析,并采用SAS(V8.2)软件分析GyrA和ParC改变和喹诺酮类耐药性的关联程度。结果44株喹诺酮类耐药菌在gyrA、parC基因QRDR均发生有义突变,gyrA83位密码子突变(TCG→TTG)最为常见,存在于43株耐药菌。混合模型分析结果显示GyrA83位、ParC80位氨基酸改变与萘啶酸的耐药性密切相关(P<0.01,R2=0.999),GyrA83、87位氨基酸改变与环丙沙星的耐药性密切相关(P<0.05,R2=0.872)。结论GyrASer83→Leu突变是导致福氏志贺菌临床株对喹诺酮类耐药的关键突变,此单位点突变即可介导福氏志贺菌对萘啶酸的耐药,但对环丙沙星耐药需同时存在GyrA和/或ParC多个位点突变或其他耐药机制。

结核病空间流行病学研究进展

结核病在全球范围内仍然是一个严重的公共卫生问题,我国是全球22个结核病高负担国家之一,据WHO报告,2007年全球共有927万结核病新发病例,其中我国约为130万[1].正确认识结核病流行传播规律对制定切实有效的控制措施具有重要意义,但由于结核病具有潜伏感染等特点,使人们对其传播流行规律的认识还很不全面.

MIRU-VNTR技术对源于河南的北京基因型结核分枝杆菌分型研究

目的:研究MIRU-VNTR技术对结核分枝杆菌北京基因型家族的分辨能力。方法:用检测RD105区缺失的多重PCR(DTM-PCR)方法对河南省源的结核分枝杆菌进行北京基因型鉴定,鉴定后的菌株检测基因分型方法VNTR-7和VNTR-16位点的分辨能力。结果:DTM-PCR获得98株结核分枝杆菌北京基因型家族菌株,VNTR-16和VNTR-7分辨率指数(Hunter-Gaston指数,HGI)为0.9983、0.9953,菌株的成簇率分别为3.1%、11.2%。结论:VNTR-16和VN-TR-7位点基因分型方法用于北京基因型家族的分析有较高的分辨能力,操作简便,适于结核病控制工作中北京基因型家族菌株占优势地区的分子流行病学研究。