系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞克隆与生长异质性

目的分离系统性硬皮病(SSc)和正常皮肤成纤维细胞(FB)克隆,观察其形态和生长特性。方法采用改良的有限稀释法分离SSc和正常皮肤FB克隆,光镜下观察克隆FB细胞形态,应用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果SSc和正常皮肤克隆FB的细胞形态均有异质性,主要分为细小梭形细胞、粗长梭形细胞和大多角形细胞3种。细胞形态呈大多角形的克隆增殖很慢,难以传代和冻存。与细胞形态呈细小梭形的克隆相比,呈粗长梭形的克隆增殖速度较慢,细胞倍增时间较长,G0/G1期细胞比例较高(P<0.05),S+G2/M期细胞比例较低(P<0.05)。SSc和正常皮肤克隆FB的细胞形态和生长特性经数次传代保持稳定。结论SSc和正常皮肤克隆FB的细胞形态和生长特性均有异质性。

系统性硬皮病患者皮肤克隆成纤维细胞胶原代谢的异质性

目的在克隆水平上研究系统性硬皮病(SSc)和正常皮肤成纤维细胞(FB)胶原代谢异质性的特点。方法以皮肤克隆FB作为研究对象,采用实时荧光定量RT-PCR法检测其Ⅰ,Ⅲ型前胶原和基质金属蛋白酶(MMP-1,MMP-3)mRNA水平;采用酶联免疫吸附法检测其细胞培养上清中Ⅰ型胶原蛋白的表达,筛选出具有不同胶原合成能力的异质性克隆,分析其胶原代谢的特点。结果 SSc和正常皮肤克隆FB的胶原代谢均具有异质性,SSc患者克隆FBⅠ,Ⅲ型前胶原mRNA水平的异质性较正常人大(F=20.540,P=0.000;F=6.822,P=0.012),SSc患者Ⅰ型前胶原mRNA高表达克隆的比例高于正常人(48.0%vs14.3%);SSc和正常皮肤克隆FB细胞培养上清中Ⅰ型胶原蛋白水平与其mRNA水平均存在正相关关系(r=0.873,P=0.000;r=0.538,P=0.039)。结论 SSc和正常皮肤克隆FB的胶原代谢均具有异质性。

细胞因子TGFβ1,CTGF和IFN-γ对系统性硬皮病克隆成纤维细胞胶原代谢的影响

目的研究细胞因子(TGFβ1,CTGF和IFN-γ)对系统性硬皮病具有不同胶原合成能力的克隆成纤维细胞胶原代谢的影响。方法采用实时荧光定量RT-PCR法检测细胞因子(TGFβ1,CTGF和IFN-γ)对系统性硬皮病具有不同胶原合成能力的克隆成纤维细胞Ⅰ型前胶原和MMP-1 mRNA水平的影响情况。结果 TGFβ1(5ng/mL)作用48h仅使具有低胶原合成能力的系统性硬皮病克隆成纤维细胞的Ⅰ型前胶原mRNA水平上升(1.20±0.50vs0.04±0.04,P=0.001);CTGF(20ng/mL),IFN-γ(100ng/mL)作用48h使系统性硬皮病克隆成纤维细胞MMP-1 mRNA水平下降(F=6.221,P=0.034;F=53.505,P=0.000),且具有高胶原合成能力的克隆成纤维细胞MMP-1 mRNA水平下降幅度大(F=8.817,P=0.016;F=8.092,P=0.019)。结论系统性硬皮病具有不同胶原合成能力的克隆成纤维细胞Ⅰ型前胶原和MMP-1 mRNA水平对细胞因子的反应存在异质性。

低氧对系统性硬化病患者皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的影响

目的研究低氧对系统性硬化病(SSc)患者和正常人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成及胶原基因表达的影响。方法分别以5例SSc患者和5例正常人皮肤成纤维细胞系作为实验对象。将成纤维细胞分别放入20%正常氧和2%低氧分压环境中培养,用分光光度仪测定细胞培养基上清液中羟脯氨酸含量,并折算成胶原蛋白含量。用Trizol提取细胞总RNA,用RT-PCR方法测定其中Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA的表达。结果培养至第6天,低氧分压条件下,SSc患者皮肤成纤维细胞培养基中胶原蛋白含量比正常氧分压条件下显著增加(t=3.97,P=0.0041);正常人皮肤成纤维细胞培养基中胶原蛋白含量此时也显著增加(t=2.63,P=0.0302)。培养至第3天,低氧分压条件下,SSc成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达量比正常氧分压条件下均有显著增加(Ⅰ型:t=5.81,P=0.0004;Ⅲ型:t=6.44,P=0.0002);正常人皮肤成纤维细胞此时的Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达量与SSc患者相似,低氧分压条件下比正常氧分压条件下均有显著增加(Ⅰ型:t=4.40,P=0.0023;Ⅲ型:t=2.24,P=0.0453)。结论低氧状态下,SSc患者和正常人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成均有增加,Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达也均增加.低氧可能是皮肤硬化的一个相关因素。

系统性硬化病成纤维细胞单克隆Ⅰ型前胶原基因转录特性的研究

目的探讨系统性硬化病（ss）患者皮损成纤维细胞高胶原合成克隆的发生机制。方法通过原位杂交法检测成纤维细胞克隆Ⅰ型前胶原理1链（COL1A1）mRNA表达，并将成纤维细胞克隆依COL1A1mRNA水平分为高、中、低组。构建5个含有人COL1A1基因不同长度转录调控序列的重组质粒，应用瞬时转染、荧光素酶报告基因技术检测5个COL1A1基因转录调控序列在不同组别成纤维细胞克隆中的启动活性。结果SS组和正常对照组不同成纤维细胞克隆COL1A1mRNA水平都具有明显差异，ss组高表达COL1A1mRNA的成纤维细胞克隆所占的比例（50．O％）高于正常对照组（12．5％），SS组成纤维细胞克隆的平均COL1A1mRNA水平显著高于正常对照组（t=3．690，P〈0．01）。5个COL1A1上游转录调控序列中-174～＋42bp在SS组和正常对照组不同成纤维细胞克隆均具有最强启动活性。COL1A1转录调控序列的活性与成纤维细胞克隆的COL1A1mRNA水平呈正相关。结论ss高胶原合成的成纤维细胞克隆的COL1A1基因在转录水平即被激活。

系统性硬化病成纤维细胞单克隆Ⅲ型前胶原基因转录特性及丹参对其的调控研究

目的探讨系统性硬化病（ss）患者皮损成纤维细胞单克隆Ⅲ型前胶原基因的转录特性及丹参对其的调控。方法构建含有人Ⅲ型前胶原仅1链（COL3A1）基因不同长度转录调控序列的重组质粒，利用瞬时转染、双荧光素酶报告基因技术检测其在ss患者皮损和正常人皮肤胶原合成异质性成纤维细胞克隆中的活性，并筛选出COL3A1近端转录调控靶序列。再通过转染、报告基因测活技术测定丹参注射液及其主要单体（丹参素钠、丹酚酸B、原儿茶醛和丹参酮ⅡA）对ss和正常人胶原合成异质性成纤维细胞克隆COL3A1近端启动区活性的调控。应用SPSS15．0软件进行统计学分析，基因转染、测活实验中。phCOLH30．1活性的比较采用t检验；丹参干预实验中，phCOLH，0．1活性的比较采用双因素方差分析，若两因素存在交互作用，再进行单因素方差分析；若无交互作用，去除交互项，检验主效应。结果6个COL3A1转录调控序列中，近端启动区-96bp-＋16bp在SS组和正常对照组不同成纤维细胞克隆具有最高或较高的活性，且其活性与克隆的胶原合成能力呈正相关。丹参注射液下调COL3A1近端启动区在ss组（阴性对照组高、低胶原合成克隆COL3A1近端启动区相对活性分别为3．879±0．309和2．150±0．262，丹参注射液组分别为2．261±0．619和1．462±0．291，与阴性对照组相比，P均〈0．01）和正常对照组高、低胶原合成克隆中的活性（阴性对照组分别为3．039±0．271和2．223±0．247，丹参注射液组分别为1．681±0．263和1．121±0．361，与阴性对照组相比，P均〈0．01）。丹酚酸B下调COL3A1近端启动区在Ss组高胶原合成克隆中的活性（为2．309±0．524，与阴性对照组高胶原合成克隆相比，P〈0．01）和在正常对照组高、低胶原合成克隆中的活性（分别为2．126±0．320和1．976±0．362，与阴性对照组相比，P〈0．05）。丹参酮ⅡA仅下调COL3A1近端启动区在ss组高胶原合成克隆中的活性（2．975±0．666，阴性对照组为5．379±0．238，P〈0．01）。丹参素钠、原儿茶醛对COL3A1近端启动区在成纤维细胞克隆中的活性无抑制作用。结论ss成纤维细胞高胶原合成克隆的Ⅲ型前胶原基因在转录水平即被激活并能被丹参注射液、单体丹酚酸B和丹参酮ⅡA抑制。

丹参对系统性硬化病高胶原合成成纤维细胞克隆Ⅰ型前胶原基因转录的调控

目的探讨丹参对系统性硬化病患者皮损高胶原合成成纤维细胞克隆Ⅰ型前胶原基因转录的调控。方法采用系统性硬化病患者皮损和正常人皮肤胶原合成异质性成纤维细胞克隆，通过四甲基偶氮唑盐比色法，检测1g／L丹参注射液及其主要水溶性单体（20mg／L丹参素钠、5mg／L丹酚酸B、5mg／L原儿茶醛）和脂溶性单体（5mg／L丹参酮ⅡA）对系统性硬化病和正常人高、低胶原合成克隆增殖活性（A490）的影响。利用瞬时转染、双荧光素酶报告基因技术，检测上述药物对克隆Ⅰ型前胶原仅1链（COL1A1）基因近端启动区活性的调控。结果在早期（≤3d），丹参注射液及单体对成纤维细胞克隆增殖的抑制不显著（P〉0．05）。但随作用时间延长，它们对克隆增殖的抑制作用多逐渐增强，第5天，丹参注射液组与水溶性阴性对照组比较，差异有统计学意义（q’=3．22，P〈0．01）；第7天，丹参注射液组、丹酚酸B组和原儿茶醛组与水溶性阴性对照组比较，差异均有统计学意义（q’分别为4．74、3．03、2．56，P值均〈0．05）。第5天和第7天，丹参酮ⅡA组与脂溶性阴性对照组比较，差异均有统计学意义（t值分别为2．22和2．15，P值均〈0．05）。丹参注射液、丹参酮ⅡA和原儿茶醛抑制系统性硬化病和正常人成纤维细胞克隆中COL1A1近端启动区的活性（P〈0．01），前两种药优先下调系统性硬化病高胶原合成克隆中COL1A1近端启动区的活性，COL1A1近端启动区在系统性硬化病高、低胶原合成克隆中的活性水溶性阴性对照组为12．019±0．830和5．388±0．480，丹参注射液组为4．445±1．061和2．856±0．597，F=31．78，P〈0．01；脂溶性阴性对照组为14．155±0．672和4．299±0．252，丹参酮ⅡA组为9．638±0．854和3．192±0．450，F=24．10，P〈0．01。结论丹参可抑制系统性硬化病高胶原合成成纤维细胞克隆Ⅰ型前胶原基因的转录，其单体丹参酮ⅡA和原儿茶醛可能发挥主要作用。

温阳活血方及丹参对硬皮病小鼠模型的影响

目的研究温阳活血方及丹参对硬皮病小鼠模型的影响。方法将温阳活血方及丹参应用于博来霉素诱导的硬皮病小鼠模型。用药小鼠分成早期给药组和硬化后给药组。两组分别分为口饲温阳活血方组、口饲丹参组和静脉注射丹参组。于用药后不同时期进行皮肤、肺组织病理学及血清自身抗体检测分析。结果与未用药的同期对照组相比,硬化后给药组至给药第5周末皮肤组织学无明显改善。早期给药组给药第5周末亦无组织学上的明显改善;第8周末,皮肤厚度比同期对照组有所降低,胶原纤维增生则有较明显改善,尤其是口饲温阳活血方组和静脉注射丹参组(P均<0.05)。肺组织学和血清自身抗体检测提示,硬化后给药和早期给药组均无明显改善。结论早期给药组小鼠随用药时间的递增,皮肤硬化得到明显改善,其中义以口饲温阳活血方组、静脉注射丹参组改善效果更明显;硬化后给药组小鼠皮肤硬化改善不明显。各组小鼠肺纤维化和血清自身抗体均无明显改善。