PTD-Calbindin D28K融合蛋白的表达、纯化及其穿膜功能的鉴定

目的 构建融合蛋白PTD CalbindinD2 8K(CaBP2 8)的表达质粒 ,并进行诱导表达、纯化 ,在体外初步鉴定其跨膜转运功能。方法 提取大鼠脑组织总RNA ,反转录后用聚合酶链反应 (PCR)法扩增编码CaBP2 8的全长cD NA序列 ,重组入 pET 32a及含有PTD的pTransVector表达载体中 ,测序鉴定后转化大肠埃希菌BL2 1(DE3) ,构建重组体的表达菌株。IPTG诱导表达后 ,以NTA Ni亲和层析柱进行分离纯化 ,SDS PAGE以及Westernblot鉴定。纯化的CaBP2 8及PTD CaBP2 8用FITC标记 ,分别以一定的浓度孵育体外培养的cos7细胞 ,最后荧光显微镜下观察两者在细胞中的分布情况 ,并用流式细胞仪 (FCM)做定量分析。结果 成功地构建了含有及不含有PTD的CaBP2 8表达载体 ,插入片断 783bp ,表达产物相对分子质量分别约 30 0 0 0、5 0 0 0 0 ,经Weternblot鉴定 ,与抗CaBPD2 8K抗体均有特异性反应。孵育培养的cos7细胞后 ,CaBP2 8 FITC仅少量吸附于细胞膜表面 ,而PTD CaBP2 8 FITC则分布于胞质内 ;FCM定量分析发现 ,细胞荧光强度随着目的蛋白的孵育浓度或孵育时间增加而增加 ,并且孵育时间为 1h时荧光达到最强。结论 重组PTD CaBP2