烟曲霉ERG3基因在米诺环素与唑类药物协同抗烟曲霉中的机制

米诺环素(MIN)是一种四环素类的抗生素,可以用于治疗多种感染性疾病,与唑类联合具有抗烟曲霉的作用。麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组成成分,ERG3基因是编码麦角甾醇合成途径后期阶段的关键酶(甾醇Δ5,6-去饱和酶)。本文通过敲除烟曲霉ERG3基因,获得ΔERG3敲除株。体外药敏实验标准M38A2法检测ΔERG3与野生株WT(ΔKU80,pyrG+)在MIN与唑类[泊沙康唑(POS)、伊曲康唑(ITR)、伏立康唑(VOR)]联合抗烟曲霉中的敏感性变化,结果显示MIN与POS联合时,POS对WT的最低抑菌浓度(MIC)值为0.03125μg/mL,分级抑菌浓度指数(FICI)值为0.1875,MIN与POS存在协同作用;POS对敲除株ΔERG3的MIC值为1μg/mL,FICI值为2,MIN与POS无协同作用。纸片法结果提示联合组(MIN+POS)或单药组(POS)中ΔERG3的抑菌圈与WT产生的抑菌圈直径相比明显变小,差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示ERG3基因敲除后,解除了MIN与POS的协同作用。进一步分析发现:野生株WT在POS和MIN联合处理组中产生的麦角甾醇与POS单药处理组相比无显著差异性,而敲除株ΔERG3在POS和MIN联合处理组中产生的麦角甾醇与POS单药处理组相比明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。另外,研究表明,联合组(MIN+POS)或单药组(POS)中烟曲霉敲除株ΔERG3产生的活性氧与WT相比明显减少。因此,ERG3参与MIN与唑类药物协同抗烟曲霉的作用通路,为MIN协同唑类抗真菌的机制提供了新的理论基础。

烟曲霉af-fadO基因敲除株构建揭示该基因在恩波吡维胺与唑类协同抗烟曲霉中的作用

恩波吡维胺(pyrviniumpamoate,PP)是一种传统抗寄生虫药,与唑类联合具有协同抗烟曲霉作用。af-fadO(FADbindingoxidoreductase,FAD依赖性氧化还原酶)基因的编码产物在烟曲霉中推定为一种与FAD结合的氧化还原酶,可能参与真菌的氧化呼吸过程。通过敲除烟曲霉af-fadO基因,构建烟曲霉af-fadO基因的敲除株,揭示该基因及其编码蛋白在PP与唑类协同抗烟曲霉中的作用,并探索了其对烟曲霉药物敏感性和渗透压、氧化压力物质敏感性的影响。本研究采用同源重组构建出af-fadO基因的敲除盒,筛选出符合的烟曲霉af-fadO敲除株Δaf-fadO。利用纸片法和棋盘法观察该突变株与野生株WT(ku80,pyrG^(+))在PP与唑类(泊沙康唑、伊曲康唑、伏立康唑)联合抗烟曲霉中的敏感性变化。同时,观察该突变株与野生株WT对氧化压力(H_(2)O_(2)和甲萘醌)、渗透压物质(NaCl、D-山梨醇)敏感性的变化。体外联合药物敏感性试验结果显示Δaf-fadO对PP与泊沙康唑的分级抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI)为0.563,显示无相互作用,而对照组WT对PP与泊沙康唑的FICI值为0.5,存在协同作用。纸片法结果发现PP与泊沙康唑联合对Δaf-fadO的抑菌圈比对照组WT产生的抑菌圈直径明显变小,PP与泊沙康唑联合时对敲除株抑制作用更显著,差异有统计学意义(P<0.05)。在渗透压和氧化应激的培养试验中,与野生株WT相比较,Δaf-fadO对氧化剂H_(2)O_(2)、甲萘醌、NaCl和D-山梨醇更敏感。敲除烟曲霉af-fadO基因后,其对氧化和渗透压力的敏感性增加,逆转了PP与泊沙康唑的协同作用,af-fadO可能是PP作用于烟曲霉的靶点。本研究丰富了PP协同唑类抗真菌的机制研究,为将来的临床应用奠定了基础。