三氧化二砷诱导犬髂动脉平滑肌细胞凋亡的实验研究

目的:研究三氧化二砷诱导犬髂动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)凋亡的作用。方法:采用 MTT、细胞生长曲线、倒置相差显微镜、细胞爬片HE染色、透射电镜等观察三氧化二砷作用后VSMC的变化。结果: VSMC细胞与三氧化二砷共孵育后出现细胞数目减少,脂肪颗粒增多;电镜等观察到核膜皱缩、核染色质凝结、边集等细胞凋亡现象,并且在一定的范围内此现象随药物浓度的增加而明显。结论:一定浓度的三氧化二砷能抑制VSMC细胞的生长．导致细胞变性．并诱导细胞凋亡。提示三氧化二砷作为涂层支架的药物可以抑制的平滑肌细胞生长,促进平滑肌细胞凋亡。

肝硬化大鼠小肠微绒毛形态和超微结构的改变与肠源性内毒素血症的关系

目的观察肝硬化大鼠小肠黏膜形态及超微结构的改变与肠源性内毒素血症的关系。方法CCl4诱导的肝硬化大鼠分为2组:肝硬化伴内毒素血症组(n=22)和肝硬化不伴内毒素血症组(n=18),另取20只健康大鼠作为正常对照组,分别观察小肠黏膜在光镜和电镜下的形态。结果光镜下观察到肝硬化伴内毒素血症的大鼠小肠绒毛明显缩短,炎症细胞浸润明显;电镜下观察到肝硬化伴内毒素血症的大鼠小肠壁超微结构明显受损,紧密连接缺失,细胞间隙扩大,肝硬化不伴内毒素血症大鼠的小肠绒毛形态以及超微结构与正常大鼠相比没有明显改变。结论肝硬化大鼠小肠黏膜损伤与肠源性内毒素血症的发生密切相关。

肝硬化大鼠小肠壁结构改变与小肠细菌过度生长和细菌转位的关系的研究

目的:观察肝硬化大鼠小肠壁结构的变化、小肠细菌过度生长和肠道细菌转位的情况,并探讨其在肠源性内毒素血症中的作用。方法:采用CCl4诱导肝硬化大鼠模型,分别取外周静脉和门静脉血测血清内毒素水平,并获取肠系膜淋巴结、肝、脾和近端空肠内容物做细菌培养。部分空肠组织作病理切片。结果:所有的肠道细菌转位(BT)均发生在有小肠细菌过度生长(SIBO)的大鼠中,肝硬化大鼠的SIBO发生率为50%(10/20),BT的发生率为35%(7/20)。正常大鼠无一只出现SIBO。肝硬化大鼠的血清内毒素水平高于正常大鼠(P<0.01).在有SIBO的肝硬化大鼠的血清内毒素水平又高于其他的肝硬化大鼠,尤以发生BT的大鼠最高。病理检查发现发生BT的肝硬化大鼠空肠绒毛变短、破坏,炎症细胞浸润增多。结论:小肠细菌过度生长和肠道细菌转位是肝硬化肠源性内毒素血症发生的重要原因之一,肠内高内毒素浓度可能与肠黏膜结构改变有关。

多烯紫杉醇对人胆管癌细胞和胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的评价多烯紫杉醇对人胆管癌细胞HCCC-9810和胰腺癌细胞BXPC-3的增殖和凋亡影响,为药物涂层支架治疗恶性梗阻性黄疸的应用提供实验基础。方法应用四硝基偶氮唑蓝法测定紫杉醇对人胆管癌细胞HCCC-9810和胰腺癌细胞BXPC-3增殖的抑制作用,Hoechst染色法检测诱导细胞凋亡。结果多烯紫杉醇可明显抑制2种肿瘤细胞株的增殖,且该抑制效应随药物剂量的增加和作用时间的延长而增强(HCCC:χ2=24.42,P<0.01;BXPC-3:χ2=24.68,P<0.01),根据增殖曲线和统计学分析,选取0.4mg/L为多烯紫杉醇最适实验浓度。凋亡分析实验显示多烯紫杉醇可诱导2种肿瘤细胞株的凋亡(HCCC:χ2=30.05,P<0.01;BXPC-3:χ2=25.22,P<0.01)。结论多烯紫杉醇有抑制BXPC-3和HCCC-9810的增殖并诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

地高辛标记探针检测重组双功能水蛭素中的DNA残留量

为检测注射用重组双功能水蛭素半成品中的DNA残留量 ,应用地高辛标记重组双功能水蛭素工程菌DNA ,并以此为DNA探针进行点杂交 ,同时做特异性及灵敏度实验。结果证明 ,该方法检测最低限值可达1pg ,且重复性好 ,特异性强 ,操作较简便 。

活性钙离子液对离体牙超微形态的影响与细胞毒性评价

目的:研究活性钙离子液对离体牙牙釉质和牙骨质超微形态的影响以及对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的细胞毒性,从而为其临床应用提供依据。方法:应用Quanta200FEG场发射扫描电镜检测钙离子液成分及含量;观察钙离子液作用于离体牙前后,牙釉质和牙骨质的超微形态;MTT比色法观察不同浓度钙离子液对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞生长的影响,计算细胞相对增殖率并进行细胞毒性分级。结果:钙离子液主要成分为钙、碳、氧、氯。通过扫描电镜观察,钙离子液浸泡离体牙后,牙釉质和牙骨质无变化。细胞毒性分级合格的钙离子液的最大浓度为0.344 mg/mL。结论:活性钙离子液能应用于口腔,但需选择适合的浓度。

肝细胞肝癌患者外周血调节性T细胞特征性糖基化改变的意义

目的:探讨肝细胞肝癌(HCC)患者调节性T细胞(regulatory T cells,T reg)N-聚糖糖基化改变及其在免疫抑制功能中的作用。方法:采用四色荧光流式细胞仪从HCC患者(研究组,n=32)和健康志愿者(对照组,n=10)外周血单个核细胞中分选CD4+CD25+CD127low/-CD49d-T reg;用凝集素芯片检测T reg中提取的细胞膜蛋白。结果:研究组外周T reg胞膜表面较对照组α-1,6-岩藻糖、α-1,6-甘露糖、N-乙酰氨基半乳糖、β型半乳糖链、复杂型N-聚糖增加。结论:T reg特征性聚糖谱改变可能伴随人体免疫功能的改变,这从糖生物学的角度为肿瘤的免疫治疗提供了新的靶点。

c-Met和整合素信号转导的交互作用与肿瘤转移

c-Met与整合素都属于肿瘤细胞表面重要的跨膜受体,可独立介导与肿瘤侵袭和转移有关的信号转导。近年越来越多的研究表明,c-Met与整合素信号系统在肿瘤细胞表面,下游信号以及两者表达水平上存在精密的相互调控。对这种交互作用的认识,将有助于进一步加深对肿瘤侵袭和转移的认识,更利于寻找有效的针对整合素与c-Met信号介导的肿瘤侵袭和转移抑制剂。

肝炎、肝硬化、肝癌及胃癌患者血清MMP-1、TIMP-1以及MMP-1/TIMP-1复合物的检测

目的 检测血清基质金属蛋白酶 -1(MMP 1)、组织金属蛋白酶抑制剂 1(TIMP 1)及两者复合物 (MMP 1/TIMP 1com plex)含量并评价其变化意义。方法 采用双抗体夹心式酶联免疫吸附法 (ELISA)对 10例健康对照、15例急性肝炎患者、15例慢性活动性肝炎患者、15例晚期肝硬化患者、15例肝癌手术患者、15例晚期肝癌患者以及 10例胃癌入院手术患者进行检测。结果 与健康对照组相比 ,慢性活动性肝炎、晚期肝硬化以及晚期肝癌患者血清TIMP 1水平显著增高 ;慢性活动性肝炎及肝癌手术患者组血清MMP 1及MMP 1/TIMP 1复合物水平显著下降 ;急性肝炎及胃癌手术患者血清MMP 1、TIMP 1及MMP 1/TIMP 1复合物含量无显著变化。结论 在慢性活动性肝炎、晚期肝硬化以及肝癌患者存在严重的MMP 1和TIMP 1的失平衡 ,这种失平衡是这些患者肝脏细胞外基质净沉积的重要原因。MMP 1和TIMP 1在急性肝炎和胃癌患者血清含量总体变化不显著。

髓样分化蛋白2在脂多糖所致大鼠急性肺损伤中的作用

目的研究髓样分化蛋白2(MD-2)在脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织中的表达及其作用。方法 20只健康雄性SD大鼠随机分为LPS组和对照组,通过支气管肺泡灌洗分离肺泡巨噬细胞,采用RT-PCR、Western blot和免疫组化方法分别检测MD-2 mRNA和蛋白的表达,ELISA方法测定血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。将MD-2 siRNA转染大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383,以终浓度1μg/mL的LPS刺激细胞,采用RT-PCR和Western blot方法分别测定细胞MD-2mRNA和蛋白的表达,ELISA方法测定细胞培养上清液TNF-α水平。结果 LPS组大鼠肺泡巨噬细胞和肺组织标本中MD-2 mRNA和蛋白的表达均显著高于对照组(P<0.01),血清TNF-α水平明显升高(P<0.01)。在LPS刺激下,NR8383细胞MD-2 mRNA和蛋白的表达显著增加(P<0.01),细胞培养上清液中TNF-α水平升高(P<0.01)。经MD-2 siRNA处理后,NR8383细胞在LPS刺激下MD-2mRNA和蛋白的表达未见明显增加(P>0.05),细胞培养上清液中TNF-α水平未见明显升高(P>0.05)。结论 MD-2在LPS所致ALI大鼠肺组织中表达显著上调,沉默肺泡巨噬细胞MD-2基因可抑制LPS刺激引起的细胞因子分泌增加,提示MD-2在LPS所致大鼠ALI中起重要作用。

兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中培养维持其表型稳定的研究

目的:软骨细胞在单层培养时,多次传代后细胞表型发生改变。将兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中作立体培养,以保持其特有表型。方法:用酶消化法获取兔关节软骨细胞,分别在普通培养瓶中作贴壁的单层培养,并传代;或制成细胞/藻酸盐悬液,再进一步制成串珠,使细胞在具有三维立体结构的串珠中生长、繁殖。细胞涂片、石蜡切片,爱尔新蓝染色,采用倒置显微镜、透射电镜观察;以RT-PCR方法检测软骨细胞中II型胶原及凝集聚糖mRNA的表达。结果:单层培养时有较高的细胞增殖率,5代以后渐失去软骨细胞特有的表型。立体培养时细胞分泌的基质大部分位于自身的周围,特有表型可长期保持稳定。3个月后藻酸盐串珠中的软骨细胞仍可测得II型胶原和凝集聚糖的表达。结论:软骨细胞在藻酸盐串珠中培养有助于其合成、分泌基质,维持细胞特有表型的稳定。

多西紫杉醇对人胆囊癌细胞的体外抑制作用

目的初步探索多西紫杉醇对人胆囊癌细胞的体外抑制作用。方法用不同浓度(1、2、4、8、16、32、64μg/mL)的多西紫杉醇处理人胆囊癌GBC-SD细胞24、48、72h,采用MTT方法检测多西紫杉醇对GBC-SD细胞增殖的影响。结果多西紫杉醇对胆囊癌细胞有明显的生长抑制作用,并且在一定范围内存在着剂量依赖关系和时间依赖关系。结论多西紫杉醇能够有效抑制胆囊癌细胞的生长。在对胆囊癌的化疗过程中,多西紫杉醇有着巨大的潜力。

超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓基质细胞经门静脉移植MRI活体示踪的研究

目的观察1.5T场强MRI联合动物专用线圈是否可以活体示踪经门静脉移植的纳米级超顺磁性氧化铁颗粒标记的骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcellsBMSCs),为介入性门静脉骨髓基质细胞移植治疗终末期肝脏疾病的研究提供进一步的依据。方法供体大鼠5只,梯度密度离心分离BMSCs,纳米级超顺磁性氧化铁颗粒和脂质体转染BMSCs,体外经普鲁士蓝染色和HE染色确定细胞标记率。受体大鼠15只,分为5组,分别为对照组和纳米级超顺磁性氧化铁颗粒标记的骨髓基质细胞经门静脉移植入正常大鼠肝脏后2h、3d、7d及2周组。1.5T场强MRI联合动物专用线圈行T1W、T2W和T2序列扫描,观察肝脏信号改变情况,与对照组比较,并且与组织切片对照。结果纳米级超顺磁性氧化铁颗粒和脂质体转染BMSCs,细胞标记率>95%。经门静脉移植入正常大鼠肝脏后,T2序列扫描显示经标记的BMSCs在肝内显示弥漫性的结节性低信号影,移植后2h到2周均可见到细胞在受体肝脏内存在,组织学切片显示信号缺失部位与铁颗粒标记细胞相一致。结论纳米级超顺磁性铁氧体颗粒标记的大鼠BMSCs经门静脉移植后可以通过1.5T场强行MRI活体示踪,为临床干细胞移植的应用提供可行的示踪方法。

大鼠骨髓基质细胞分离培养和经门静脉途径移植的初步研究

目的 观察骨髓基质细胞 (marrowstromalcell,MSC)经门静脉移植后在同种异体大鼠体内的转归 ,为MSC体内诱导转化及功能发挥的研究提供基础。方法 采用连续传代培养的方法纯化MSC ,DAPI标记后经门静脉移植入受体 ,移植细胞数量为 10 5个 /只 ,2 0只受体大鼠分为 4组 ,各组分别于移植后 2h、1周、2周、3周、4周处死 ,观察受体肝脏及肺脏内DAPI标记的移植细胞的分布和存活情况。结果 体外培养的MSC具有良好的增殖能力 ,2 0只受体大鼠 4只死亡 ,其余均存活至处死前 ,MSC经门静脉植入异体大鼠后 2h、1周、2周、3周、4周受体肝脏内均可见DAPI标记的移植细胞存活 ,而各期受体肺内未见DAPI标记的移植细胞存活。结论 经门静脉注入MSC后 ,细胞主要分布于受体肝脏 ,在肝脏内分布呈现由门静脉小分支逐渐向肝实质内移行的过程 ,并与肝细胞紧密结合呈索状排列。

CD151在原发性肝细胞癌中的表达及其意义

CD151是最早发现与肿瘤转移呈正相关的四跨膜蛋白，是四跨膜网络形成最为关键的分子之一。迄今已在胃癌、前列腺癌、肺癌的研究中均发现其过表达与肿瘤的转移与复发有关，但在肝癌中的表达情况鲜见报道。我们通过检测原发性肝细胞癌、癌旁与正常肝脏组织中CD151蛋白及mRNA的表达睛况并分析其与肝癌临床病理学因素间的关系，对CD151在原发性肝细胞癌的侵袭与转移中的作用作进行了初步探讨。

脂多糖对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体4和髓样分化蛋白-2基因表达及炎性因子分泌的影响

目的 探讨脂多糖刺激大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞Toll样受体4（TLR4）、髓样分化蛋白-2（MD-2）mRNA表达和炎性因子分泌的影响,以及MD-2小干扰RNA（MD-2 siRNA）对脂多糖刺激下NR8383细胞炎性因子分泌的作用.方法 体外培养NR8383细胞,以不同浓度脂多糖（0.01～10 mg/L）刺激2 h,以1 mg/L脂多糖刺激2～24 h.运用脂质体Lipofectamine 2000将MD-2siRNA转染至细胞.半定量RT-PCR方法检测细胞TLR4和MD-2 mRNA的表达,酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6和IL-1β的含量.统计学处理采用单因素方差分析、独立样本t检验和Pearson相关分析.结果 对照组NR8383细胞TLR4和MD-2mRNA的相对表达量分别为0.52±0.05和0.44±0.09,0.01 mg/L浓度脂多糖刺激前后表达量无明显改变,0.1 mg/L浓度时表达增加,随脂多糖浓度的升高表达量进一步增加,10 mg/L刺激后相对表达量分别为0.72±0.06和0.65±0.10（F=17.26、6.04,P〈0.01）;TNF-αIL-6和IL-1β含量具有类似改变趋势,对照组分别为（25.8±3.4）ng/L、（62.4±4.7）ng/L和（31.6±1.7）ng/L;在10 mg/L脂多糖刺激下分别增加至（58.9±5.3）ng/L、（96.5±3.9）ng/L和（55.4±5.4）ng/L（F=29.55、54.47、31.45,P〈0.01）.在1 mr/L脂多糖刺激下,TLR4和MD-2 mRNA的表达量在2 h后明显增加,6 h达高峰,8 h开始回落,至24 h时仍高于基础值（F=5.28、4.11,P〈0.01）;TNF-α、IL-6和IL-1β含量具有类似变化（F=10.64、11.23、17.58,P〈0.01）,其中TNF-α和IL-1β含量在6 h达高峰,持续至8 h,IL-6含量在8 h达高峰,持续至12 h.TLR4和MD-2 mRNA表达呈正相关（r=0.513,P〈0.01）.MD-2 siRNA对NR8383细胞MD-2基因的干扰效率为67%,在脂多糖刺激下干扰组细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平未见明显升高.结论 高浓度脂多糖可较长时间上调大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞TLR4和MD-2基因的表达,并促进TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌.MD-2 siRNA可抑制脂多糖刺激下NR8383细胞分泌TNF-α、IL-1 β和IL-6.

免疫调节因子分泌型纤维介素蛋白2在慢性乙型肝炎长期抗病毒治疗中的动态变化

目的分析慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前后外周血中分泌型纤维介素蛋白2（sFGL2）表达水平的变化。方法纳入2013年7月至2014年12月就诊的初治慢性乙型肝炎患者（采用恩替卡韦进行抗病毒治疗）和健康对照者。收集患者基线及随访期的临床资料，并以ELISA法检测所有纳入对象的血浆sFGL2水平。所有患者基线时均行肝活组织穿刺检查，部分患者于治疗后78周行第2次肝活组织穿刺检查，采用免疫组织化学法检测肝组织内sFGL2的表达。统计学方法采用t检验、Wilcoxon法和相关性分析。结果共纳入71例慢性乙型肝炎患者和20名健康对照者。基线时，慢性乙型肝炎患者血浆sFGL2水平为105．6μg／L（78．3μg／L，151．6μg／L），高于健康对照者的25．2μg／L（18．8μg／L，34．3μg／L），差异有统计学意义（χ^2=5．887，P〈0．01）；肝硬化组患者血浆sFGL2水平为146．0μg／L（111．3μg／L，166．8μg／L），高于非肝硬化组的79．0μg／L（65．4μg／L，107．4μg／L），差异有统计学意义（χ^2=4．912，P〈0．01）。血浆sFGL2水平与肝脏硬度值、肝组织炎症及纤维化分期均呈正相关（r=0．426、0．240、0．655，P均〈0．05）。治疗后26、52周的血浆sFGL2水平分别为89．1μg／L（69．8μg／L，125．5μg／L）、75．8μg／L（53．4μg／L，98．9μg／L），呈逐渐下降趋势（治疗后26周比基线Z=-4．499，P〈0．01；治疗后52周比26周Z=-4．762，P〈0.01）。基线时，肝硬化组肝组织中sFGL2表达阳性细胞数为33．0±10．4，高于非肝硬化组的17．6±6．7，差异有统计学意义（t=7．541，P〈0.01）；与基线状态（24．5±2．0）相比，治疗78周时肝组织中的sFGL2阳性细胞数（11．3±1．6）减少，差异有统计学意义（t=11．980，P〈0.01）。结论慢性乙型肝炎患者外周血sFGL2水平与肝脏炎症及纤维化程度密切相关，长期抗病毒治疗后血浆sFGL2水平显著下降。

多西紫杉醇诱导胆囊癌细胞凋亡的研究

多西紫杉醇是一种新型抗肿瘤药物,对多种肿瘤均有良好的生长抑制和诱导细胞凋亡的作用[1].本研究旨在观察该药对胆囊癌细胞GBC-SD增殖和凋亡的影响. 一、材料与方法 1．材料：胆囊癌细胞株GBC—SD购于上海中国科学院生化细胞所。多西紫杉醇由齐鲁制药有限公司生产。