大鼠胚胎脊髓源性神经干细胞的培养和分化

目的 探讨大鼠脊髓源性胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化，为进一步的实验研究提供基础。方法 取孕14～16d的SD大鼠胚胎脊髓在条件培养基中培养增殖传代分化，用神经干细胞特异性抗体-巢蛋白（Nestin）鉴定克隆细胞，用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。用Brdu免疫荧光对神经干细胞传代能力检测。结果 获得了大量能自我增殖并分化的神经干细胞，分化后主要产生神经元特异性微管相关蛋白染色阳性的神经元质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和少突胶质细胞三种神经组织细胞。Brdu免疫荧光显示神经球中绝大多数细胞为Brdu阳性细胞，其细胞核中可见荧光标记物。结论 大鼠胚胎脊髓能分离、培养出神经干细胞，并能诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶细胞。

生地注射液对凝血酶损伤后神经元保护的实验研究

目的观察凝血酶对神经元的作用,并筛选凝血酶损伤神经元的最小剂量,探讨生地注射液对神经元损伤的保护作用。方法培养胎鼠大脑皮质神经元细胞。将接种于96孔板的神经元培养7d后分为6组,每组12个孔,依次加入0(对照组)、25、50、75、100和150kU/L凝血酶,观察凝血酶对神经元的损伤作用。将接种于96孔板的神经元培养7d后分为12组,每组8个孔,设正常对照组,其余11组分别加入75kU/L凝血酶作用24h后,依次加入体积分数为1%、2%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、8%、10%的生地注射液。观察各组神经元病理形态学改变;以四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和乳酸脱氢酶(LDH)释放量来反映神经元数量和活性。结果与对照组比较,25kU/L凝血酶组LDH显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),其他组LDH值随凝血酶剂量增加呈增高趋势,且75、100和150kU/L凝血酶组与对照组比较差异有统计学意义(P均<0.01)。与对照组比较,除25kU/L凝血酶组MTT值升高外,其他组MTT值均显著下降,且与对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.01);综合LDH与MTT值的结果,筛选出凝血酶损伤神经元的最小剂量为75kU/L。在生地注射液干预实验中,与正常对照组比较,生地注射液各浓度组LDH值均降低,MTT值均升高,除10%组MTT值外,其余各值间差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。光镜和电镜下观察正常对照组和生地注射液各浓度组神经元细胞形态均显示正常;凝血酶各浓度组细胞则有不同程度损伤。结论生地注射液能够提高凝血酶损伤后神经元存活率、抑制LDH释放,从而对神经元起到保护作用。

腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP的构建和在神经干细胞中的表达

目的研究腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP的构建及其在神经干细胞(NSCs)中的表达。方法通过RT-PCR从大鼠海马中获得BDNF基因,通过基因克隆、HEK293包装,获得含增强绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒表达载体pAd-BDNF-EGFP,将其感染原代培养的神经干细胞,观察EGFP及BDNF2种基因的表达,镜下测定转染率,并检测RT-PCR产物,证实BDNF的存在。转染后的神经干细胞经G418筛选,抗性细胞传代扩增后获得成功转染BDNF基因的NSCs克隆。结果荧光显微镜下可见感染后的NSCs表达EGFP而发出绿色荧光;通过RT-PCR证明感染后的NSCs具有表达BDNF的能力;用ELISA鉴定细胞上清中分泌的BDNF,72h的含量达到最高值,为12.78ng/mL;证明通过构建病毒的感染可以使神经干细胞获得分泌BDNF的能力,且EGFP基因可作为神经干细胞移植研究中良好的示踪剂。结论腺病毒病毒介导EGFP基因及BDNF基因在大鼠胚胎神经干细胞中成功表达,为应用以神经干细胞直接作为基因靶细胞,介导基因治疗中枢神经系统疾病奠定了基础。