补肾宁心方对去势雌兔免疫功能的影响

为探讨补肾宁心方对去势雌兔免疫功能的影响。24只3月龄新西兰雌兔随机分为正常对照组、假手术组、去势组(卵巢切除)、中药组(卵巢切除并灌以补肾宁心中药复方),除正常对照组外均于卵巢切除2周后给予高脂饮食,中药组同时灌胃给药,其余各组均灌服等量的蒸馏水,连续3个月。采用MTT法测定外周血淋巴细胞增殖反应;同时采用半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测动物脾脏IL-2、IL-10 mRNA的表达量。结果显示:雌兔去势后,动物外周血淋巴细胞增殖活性较正常对照组明显降低;补肾宁心方灌药后动物的外周血淋巴细胞增殖活性明显增强,补肾宁心方对动物脾脏的IL-2 mRNA表达水平有明显的上调作用,而对动物脾脏的IL-10mRNA表达水平有明显的下调作用。

分子佐剂C3d3与hCGβ基因融合增强hCGβ基因疫苗体液免疫应答

目的:提高hCGβ在真核细胞中的表达效率,观察分子佐剂C3d3增强hCGβ基因疫苗的体液免疫应答。方法:构建带有增强目的基因表达效率的狗胰岛素前原信号肽(DPPISS)的高效真核表达质粒pCMV4hCGβC3d3、pCMV4hCGβ和pCMV4C3d3。分别用pCMV4DPPISShCGβC3d3、pCMV4DPPISShCGβ和pCMV4DPPISShCGβ联合pCMV4DPPISSC3d3免疫BALBc小鼠,各组免疫剂量分别为5、10、50、100、500pmol,间隔3周相同剂量加强免疫1次。间接ELISA法分析免疫小鼠外周血抗hCGβ抗体动态变化以及IgG亚型。结果:含有DPPISS的pCMV4hCGβC3d3较无DPPISS的pCMV4hCGβC3d3在COS7细胞中的表达效率明显提高。50pmol是BALBc小鼠hCGβ基因免疫的最佳免疫剂量。C3d3使得BALBc小鼠hCGβ的免疫原性增强了400倍。hCGβC3d3免疫组IgG1IgG2a比值明显高于hCGβ免疫组和hCGβ与C3d3联合免疫组。结论:分子佐剂C3d3与hCGβ基因融合能够显著增强hCGβ基因避孕疫苗的体液免疫应答及抗体类型转换。

C3d3与hCGβ基因融合质粒对不同品系小鼠DNA免疫增强抗hCGβ体液免疫效应

目的通过分子佐剂C3d3增强人绒毛膜促性腺激素(hCG)β基因疫苗在不同品系小鼠的体液免疫效应。方法分别用pCMV4-hCG-βC3d3、pCMV4-hCGβ和pCMV4-hCGβ+pCMV4-C3d3联合免疫以辅助性T细胞(Th)2型优势的BALB/c小鼠和Th1型优势的C57BL/6小鼠,免疫剂量分别为5、10、50、100和500 pmol,同一剂量免疫两次、间隔3周。初次及加强免疫后每周采血,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清抗hCGβ抗体水平。硫氰酸钠洗脱法ELISA分析抗hCGβ抗血清亲和力。结果两种品系小鼠pCMV4-hCG-βC3d3免疫产生抗hCGβ抗体的时间和效价均显著早(高)于pC-MV4-hCGβ和联合免疫组。在50 pmol免疫剂量时,C3d3在两种品系小鼠呈现出最强的佐剂活性,分别使hCGβ的免疫原性增强了400倍(BALB/c)和251倍(C57BL/6)。pCMV4-hCG-βC3d3组两个品系小鼠亲和力成熟较快。结论在Th2型及Th1型免疫优势的不同品系小鼠,分子佐剂C3d3均能增强hCGβ基因疫苗体液免疫效应。

脱氢表雄酮对去势雌兔免疫功能的调节作用

目的观察脱氢表雄酮(DHEA)对去势雌兔免疫功能的影响。方法24只3月龄新西兰雌兔随机分为正常对照组、假手术组、去势对照组(卵巢切除)、DHEA治疗组(卵巢切除并以10mg·kg-1.d-1的剂量口服DHEA)。卵巢切除后2w,治疗组灌胃给药,其余各组均灌服等量蒸馏水,连续3个月。采用MTT法测定外周血单个核细胞增殖反应;同时采用半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测动物脾脏IL-2、IL-10 mRNA的表达量。结果雌兔去势后,动物外周血单个核细胞增殖活性较正常对照组明显降低;DHEA治疗后动物的外周血单个核细胞增殖活性明显增强,DHEA对动物脾脏的IL-2 mRNA表达水平有明显的升调节作用,而对动物脾脏的IL-10 mRNA表达水平有明显的降调节作用。结论DHEA对去势雌兔的免疫功能有促进作用,且使脾脏免疫活性细胞的细胞因子转录由Th2型(IL-10)向Th1型(IL-2)偏移。

hCGβ-C3d3基因免疫BALB/c小鼠选择性促进B细胞克隆扩增

评价分子佐剂C3d在基因免疫中选择性促进抗原特异性B细胞增殖作用。分别用质粒pCMV4-hCG-βC3d3和pCMV4-hCGβ免疫BALB/c小鼠,免疫剂量为50 pmol。间隔3周相同剂量加强免疫1次。加强免疫后第1周及第2周,MTT法分析各组小鼠脾脏B细胞和T细胞增殖;ELISPOT法分析两免疫组小鼠脾脏hCGβ抗原特异性IgG分泌细胞。结果显示在加强免疫后第1周及第2周,hCG-βC3d3免疫组B细胞增殖能力显著高于hCGβ免疫组及正常对照组;而各组间T细胞增殖状况未见明显差异。hCG-βC3d3免疫组较hCGβ免疫组小鼠脾细胞分泌IgG的量和分泌hCGβ抗体的细胞数量均明显增加。结果表明分子佐剂C3d对于B细胞具有选择性克隆扩增作用。

补肾宁心方对单核-内皮细胞在动脉粥样硬化中相互作用的影响

目的 探讨补肾宁心方对动脉粥样硬化中单核 -内皮细胞相互作用的影响。方法 以培养人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)作为靶细胞 ,在内皮细胞培养基中加入氧化型低密度脂蛋白 (ox- LDL)并在试验体系中加入灌服补肾宁心方的兔血清 ,收集内皮细胞条件培养基 ,作用于人单核细胞系 U937细胞 ,检测内皮细胞条件培养基中 MCP- 1的含量及内皮细胞表面粘附分子、细胞间粘附分子 - 1 (ICAM- 1 )、血管细胞粘附分子 - 1(VCAM- 1 )的表达 ,同时测定 U937细胞 CCR2、LFA- 1以及 VL A- 4 m RNA水平。结果 ox- LDL显著升高内皮细胞条件培养基中 MCP- 1的含量 ,明显促进内皮细胞表面 ICAM- 1、VCAM- 1的表达 ,且在内皮细胞条件培养基作用下单核 U937细胞 CCR2、L FA- 1以及 VL A- 4 m RNA水平明显升高。如在试验体系中加入灌服补肾宁心方的动物血清 ,则 MCP- 1含量明显下降 ,内皮细胞表面 ICAM- 1、VCAM- 1的表达显著下调 (P<0 .0 1 ) ,且在条件培养基作用下单核 U937细胞 CCR2、LFA- 1以及 VLA- 4 m RNA水平明显下调。结论 补肾宁心方含药血清可能通过抑制内皮细胞分泌趋化因子、下调内皮细胞表面粘附分子的表达 ,抑制内皮细胞对单核细胞的趋化及相互粘附 ,从而发挥对血管内皮细胞的保护作用。

补肾宁心方对小鼠绝经后骨质疏松的影响

目的探讨补肾宁心方防治绝经后骨质疏松的作用。方法建立BALB/c小鼠绝经后骨质疏松模型,灌服补肾宁心方浓缩液(简称补肾方组),并以17β-雌二醇为阳性对照(简称E2组),以生理盐水为阴性对照(简称模型组)。12周后处死,取血测Th1/Th2型细胞因子;取椎骨(L3-4)和左股骨测骨密度(BMD);取右股骨行骨组织形态计量分析;胫骨提取总RNA,半定量RT-PCR分析护骨素(OPG)的mRNA表达。计算子宫对体重的比值,并行子宫组织切片观察。结果补肾方组的IFN-γ水平较模型组明显升高(P<0.01),而IL-4水平低于模型组(P<0.05)。补肾方组与E2组小鼠的BMD均改善,骨小梁面积增加,OPG mRNA表达增加;但补肾方组小鼠的子宫明显小于E2组(P<0.05),与模型组比较差异无显著性。结论补肾方能够选择性地防治绝经后骨质疏松,对子宫无或仅有轻微的刺激作用。其机制可能与调节Th1/Th2的偏移及提高OPG的表达,抑制破骨细胞的活性有关。

补肾中药血清对血管内皮细胞损伤的保护作用

目的探讨补肾中药血清对血管内皮细胞损伤的影响。方法以培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为靶细胞.灌服蒸馏水的兔血清为对照,在内皮细胞培养基中加入氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL),并在试验体系中加入灌服补肾中药的兔血清,收集内皮细胞培养上清液,以硝酸还原酶法检测一氧化氮(NO)的含量,硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)的含量;流式细胞仪Annexin V-PI双染色法检测内皮细胞的凋亡发生率,透射电镜观察内皮细胞超微结构的变化。结果ox-LDL显著降低内皮细胞培养上清液中NO水平,升高MDA的含量,促进内皮细胞凋亡,透射电镜显示内皮细胞内线粒体肿胀明显。在试验体系中加入灌服补肾中药的兔血清。则NO水平明显升高,MDA含量明显下降.内皮细胞凋亡率下降(P<0.01),同时内皮细胞内线粒体变化趋于正常;而灌服蒸馏水的兔血清则无此作用。结论补肾中药血清对于ox-LDL造成的内皮细胞损伤具有保护作用。

补肾宁心方对去卵巢兔动脉粥样硬化的保护作用

目的研究补肾宁心方对去卵巢兔动脉粥样硬化形成的影响。方法 2 6只 3月龄新西兰雌兔随机分为正常组、假手术组、对照组 (卵巢切除 )、中药组 (卵巢切除并灌以补肾宁心方 ) ,除正常组外均于手术2周后给予高脂饮食 ,中药组同时灌胃给补肾宁心方中药 ,连续 3个月。各组于第 12周末测定血脂 (TC、TG、LDL C和HDL C)以及一氧化氮 (NO)水平 ;取主动脉行组织形态学观察以及在光镜和扫描电子显微镜下行病理学检查 ,利用图像分析仪计算动脉粥样硬化斑块内膜面积比和内膜中膜厚度比、面积比。结果 12周末除正常组外 ,各组动物血脂测定结果比较 ,差异无显著性。与对照组比较 ,中药组血清NO水平明显升高 ,主动脉硬化斑块面积与动脉内膜比值 ,内膜中膜厚度比、面积比均明显降低 ,主动脉病理变化减轻。结论补肾宁心方可抑制去势雌兔动脉粥样硬化形成 。

补肾宁心方对去势高脂血症家兔主动脉血管细胞粘附分子1表达的调节

为了探讨补肾宁心方对去势雌兔动脉粥样硬化形成的影响及其可能的机制,将26只3月龄新西兰雌兔随机分为正常对照组、假手术组、去势对照组和治疗组(卵巢切除并灌以补肾宁心中药复方),除正常对照组外均于术后2周给予高脂饮食,治疗组同时灌胃给药,连续3个月。12周末测定血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平;取主动脉行组织形态学及扫描电镜观察,并应用免疫组织化学方法检测主动脉血管细胞粘附分子1的蛋白表达。结果发现,与去势对照组比较,补肾宁心方对血脂变化无明显影响,但能明显降低主动脉粥样斑块面积与动脉内膜比值,降低内膜中膜厚度比,减轻主动脉病理损害,抑制主动脉血管细胞粘附分子1的蛋白表达。结果提示,补肾宁心方可能通过抑制主动脉血管细胞粘附分子1的表达从而阻止动脉粥样硬化的发生发展。

脱氢表雄酮抑制骨吸收的作用机制

目的 研究脱氢表雄酮 (DHEA)治疗绝经后骨质疏松的作用机制。方法 体外分离和培养成骨细胞和破骨细胞 ,在有或无成骨细胞存在的条件下 ,观察 10 - 7mol·L- 1 的DHEA对破骨细胞骨吸收作用的影响 ;经DHEA作用 1,2 ,3d后 ,半定量RT PCR测定护骨素 核因子κB受体活化因子配基 (OPG RANKL)的mRNA水平。结果 10 - 7mol·L- 1 的DHEA能明显增加成骨细胞OPG RANKL的mRNA比值 (P <0 0 1) ;当成骨细胞存在时 ,DHEA可以减少骨吸收陷窝的数目 (P <0 0 5 )和面积 (P <0 0 1)。结论 DHEA只有在成骨细胞存在时可以抑制破骨细胞的骨吸收作用 ,该作用可能通过间接调节成骨细胞OPG RANKL的转录而介导。

补肾宁心方对小鼠成骨细胞的增殖和抗凋亡作用

目的 探讨补肾宁心方促进成骨细胞增殖和抗凋亡作用。方法 建立BALB/c小鼠绝经后骨质疏松模型,给予中药补肾宁心方浓缩液(简称中药组)灌服12周,灌服雌激素为阳性对照组(简称E2组),灌服生理盐水为阴性对照组(简称对照组)。12周末处死各组动物取颅骨,以植块法培养成骨细胞,MTT法测其增殖能力;取股骨,以透射电镜观察其细胞器的变化;取药物血清体外观察其抗成骨细胞凋亡作用。结果中药组和E2组细胞器丰富,高尔基体发达,胶原纤维致密;中药组比对照组来源的成骨细胞具有更强的增殖能力(P<0.05);10％-20％的中药药物血清在体外能有效抑制成骨细胞的凋亡。结论 中药补肾宁心方具有促成骨细胞增殖和抗凋亡作用。

分子佐剂C3d上调Raji细胞协同刺激分子B7-1和B7-2的表达(简报)

我们在以往研究中，引入选择性增强体液免疫效应的新型分子佐剂C3d，成功构建了重组避孕疫苗hCGβ-C3d3，通过免疫Th2型优势的BALB／c小鼠和Th1型优势的C57BL／6小鼠．显示分子佐剂C3d在不同品系小鼠均使免疫效应从Th1型细胞免疫向Th2型体液免疫偏倚。

脱氢表雄酮对成骨细胞ERβ的上调节作用

目的研究脱氢表雄酮（DHEA）对成骨细胞雌激素受体（ER）亚型的调节及防治绝经后骨质疏松的作用机制。方法取新生2—4dBALB／c小鼠颅骨，用酶消化法进行成骨细胞原代培养并鉴定。取原代培养的成骨细胞，模仿雌激素撤退现象后，给予不同时间1×100mol·L^-1的DHEA培养，透射电镜观察细胞器的变化，RT-PCR分析成骨细胞护骨素（OPG）／破骨细胞分化因子（RANKL），ER亚型的表达；同时分析ER亚型与OPG生成的相关性。结果1×10^-7mol·L^-1的DHEA使成骨细胞的细胞器更为丰富，糖原减少，高尔基体发达且分层增多；对成骨细胞ERα的表达无明显影响，却增高OPG／RANKL．ERβ的表达（均为P〈0．01），二者的表达水平呈明显正相关（P〈0．01）。结论DHEA能够增高OPG／RANKL的表达，从而抑制骨的吸收；其作用机制与ERβ的上调有关。

猪ZP4B细胞表位人源化定点突变

目的 :对编码猪ZP4的cDNA序列进行人源化定点突变 ,使原来编码LDPENLTL八肽表位的序列突变成编码相应人卵透明带上LDPEKLTL序列 ,同时保持其他序列不变。方法 :采用PCR重叠延伸法 ,连续进行 3次PCR ,对PZP4B细胞LD PENLTL八肽表位进行定点突变。第 3次PCR以前两次PCR的产物为模板 ,最终得到所需的突变体hpZP4和dpZP4。结果 :突变后的cDNA序列通过重组DNA技术 ,在突变体片段 5′及 3′末端分别引入SalI和NcoI内切酶位点 ,使其克隆入pBV2 2 1表达质粒中 ,制成hpZP4 pBV2 2 1,pZP4 pBV2 2 1和dpZP4 pBV2 2 1重组质粒。经测序 ,证明均为目的序列。结论 :通过定点突变产生人源化猪ZP4B细胞表位是可行的。研究将为人类克隆并制备新的人卵透明带避孕疫苗奠定基础。

补肾宁心方对人单核-血管内皮细胞粘附的影响

目的 :探讨补肾宁心方对人单核 -血管内皮细胞粘附的影响及机理。方法 :以培养人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)作为靶细胞 ,在内皮细胞培养基中加入氧化的低密度脂蛋白 (ox -LDL)或在试验体系中加入灌服补肾宁心方的兔血清 ,以孟加拉玫瑰红活细胞染色法测定人单核细胞系U937与HUVECs的粘附 ,并用流式细胞仪检测内皮细胞表面粘附分子细胞间粘附分子 - 1(ICAM - 1)、血管细胞粘附分子 - 1(VCAM - 1)以及E -选择素的表达。结果 :ox -LDL显著增强单核U937细胞与内皮细胞之间的相互粘附 ,如在试验体系中加入灌服补肾宁心方的动物血清 ,则粘附率明显降低 (P <0 0 1)。流式细胞仪分析结果显示ox -LDL能明显促进内皮细胞表面ICAM - 1、VCAM -1以及E -选择素的表达 ,补肾宁心方中药灌服血清可显著下调内皮细胞表面ICAM - 1、VCAM - 1以及E -选择素的表达 (P <0 0 1)。结论 :补肾宁心方含药血清可能通过下调内皮细胞表面粘附分子的表达抑制单核 -血管内皮细胞粘附 ,从而发挥对血管内皮细胞的保护作用。

雌激素受体家族及其相关的辅助因子

比较了雌激素受体α、β的六个功能区,其中两者AF-2区的中心序列相同,而AF-1区无明显同源性。结构的不同决定了功能上的差异,雌激素受体α在介导雌激素的效应中起着主要的作用,受体β对受体α有抑制作用,且受体α、β在不同组织有不同的优势表达。在雌激素受体信号转导中的辅助因子有共激活因子和共抑制因子两大类。

脱氢表雄酮通过丝裂活化蛋白激酶途径促进成骨细胞增殖的研究

目的研究脱氢表雄酮(DHEA)促进成骨细胞增殖的作用和机制。方法取新生2～4d的BALB/c小鼠颅骨,用酶消化法进行成骨细胞原代培养,以细胞形态学和碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定。取传1代成骨细胞给予不同浓度DHEA,在不同培养时间后,应用光镜、电镜、四唑盐(MTT)法及流式细胞术(FCM)检测细胞的生长和增殖;同时用免疫印迹法检测磷酸化细胞外信号调控激酶(p44/42)的表达。结果10-8～10-6mol/L的DHEA可明显促进小鼠成骨细胞的生长和增殖,经10-7mol/LDHEA处理3d后的细胞,增殖指数明显增加(P<001);在10-9～10-6mol/L浓度范围内,DHEA能明显提高p44/42的表达,以10-8mol/L浓度的作用最佳(P<001),该作用可被U0126阻断。结论DHEA能够促进小鼠成骨细胞生长和增殖,其作用与激活丝裂活化蛋白激酶信号途径有关。