基于二代测序技术的多源遗传标记检测体系的构建与验证

近年来,法医实践中对复杂亲缘关系的鉴定需求越来越多,需要联合多种遗传标记进行判断,如STR、X/Y遗传标记、SNP、线粒体DNA等。二代测序技术可以将多种遗传标记纳入一个检测体系中。本文报道了开发出的一套包含29个常染色体STR、36个Y-STR、32个X-STR、71个Y-SNP以及mtDNA全基因组的检测体系DNATyperTMNGSPanel v1.0。根据DNA分析方法科学工作组(SWGDAM)的验证指南,对该体系的重复性、准确性、一致性、灵敏度、混合样本、物种特异性等指标进行了评估。结果表明,该体系分型结果与毛细管电泳的一致性为99.72%,与ForenSeq™DNA Signature Prep Kit试剂盒相重合的基因座结果均完全一致。在0.5~10 ng DNA模板量范围内无等位基因丢失,而在0.25、0.125 ng时分别出现2、9个基因座的丢失。在男女混合比例为2:1时女性成分开始出现等位基因丢失,混合比例为9:1、4:1、2:1、1:1时,检出率分别为54.72%、81.13%、98.11%、100%,若男女混合比例为1:4则男性成分开始出现等位基因丢失,当混合比例为1:1、1:2、1:4、1:9时检出率分别为100%、100%、90.24%、82.93%。该体系对猪、牛、鼠、食蟹猴、恒河猴的DNA几乎没有扩增发生。因此,本体系的检测通量高,灵敏度和稳定性高,分型准确性和重复性好,对混合样本的检出能力较强。通过单次检测就可同时获得父系、母系相关的遗传信息,能有效提高个体识别能力和亲权鉴定效能。

中国汉族人群线粒体DNA单倍群与尿酸水平的关联研究

尿酸(UA)是人体内嘌呤核苷酸代谢的最终产物,与多种慢性疾病相关。因线粒体处于人体代谢的核心位置,线粒体DNA变异可能影响血液中尿酸水平。本研究对来自广西南宁、江苏泰州和河南郑州的3个中国汉族人群共计2837例样本(其中男性样本1112例、女性样本1725例)进行分析,对样本初始的UA值矫正了性别和年龄因素。本研究根据线粒体DNA的变异将受试者分为16种基础单倍群,通过比较每个单倍群样本和其他样本的UA水平差异,探索线粒体单倍群和UA的相关性。在总体3个汉族人群中,M8单倍群的UA矫正值((310.5±87.2)μmol/L)显著低于其他单倍群((326.1±80.6)μmol/L,P=0.02),B5单倍群的UA矫正值((338.8±72.5)μmol/L)显著高于其他单倍群((324.9±81.2)μmol/L,P=0.01)。本研究结合后续分析发现,在总人群、南宁人群和泰州人群女性数据中,M8单倍群均与低UA水平显著相关;在总人群和女性数据中,B5单倍群与高UA水平显著相关。综上所述,本研究在中国汉族人群中发现了与UA水平显著相关的线粒体单倍群,为后续线粒体DNA变异在尿酸代谢中的作用机制研究提供线索。

一种高通量自动化血浆miRNA文库构建方法及其跨批次性能评估

目的建立一种适用于低起始量血浆样本的高通量(96样本/批次)、自动化miRNA文库构建方法,并系统评估该方法的可靠性与跨批次一致性。方法基于PerkinElmer公司的NEXTFLEX^(■)small RNA-seq试剂盒和Sciclone^(■)NGSx液体工作站,建立自动化miRNA文库构建方法。制备3类血浆参考物质(分别来自健康男性、健康女性和糖尿病患者)模拟临床血浆样本,并使用自动化建库方法进行4个批次文库构建实验。从miRNA检出种类、绝对定量、不同样本间相对定量及差异表达分析等层面评估方法性能及跨批次一致性。结果miRNA检出种类一致性:批次内和批次间并交比(Jaccard index)分别为0.61和0.62;miRNA表达水平绝对定量一致性:批次内和批次间Pearson相关系数平均值均为0.96;两个不同样本间相对定量水平在不同批次间的相关系数平均值为0.74,且超过60%的差异表达miRNA可在多个批次中检出。结论本研究建立了一种高通量自动化血浆miRNA文库构建方法,具有良好的批次内性能和跨批次一致性,可用于大型队列血浆miRNA文库构建实验。

同型半胱氨酸在口腔健康状态与颈动脉内膜中层厚度关系中的中介效应分析

目的探讨口腔健康状态与颈动脉内膜中层厚度(carotid intima⁃media thickness,cIMT)的关系,以及血清同型半胱氨酸(homo⁃cysteine,HCY)在其中的中介作用。方法利用2019年6月15日―2020年1月12日浙江省绍兴市某医院体检项目参与者数据,将691名≥50岁具备完整的口腔检查结果、cIMT检查结论及相关数据者作为研究对象。采用多因素logistic回归分析模型分析口腔健康状态与cIMT的关联。采用Bootstrap方法检验血清HCY在口腔健康状态和cIMT关系中的中介效应。结果多因素logistic回归分析模型调整协变量后,口腔不健康组检出cIMT增厚的可能性是口腔健康组的2.04倍(OR=2.04,95%CI:1.48~2.81)。中介效应分析结果显示,血清HCY在口腔健康状态与cIMT的关联中发挥了部分中介效应(间接效应=0.04,95%CI:0.01~0.06,P<0.001),占总效应的21.89%(P<0.001)。结论口腔不健康状态可能与cIMT增厚相关,且血清HCY在其中发挥了一定的中介作用。

基于时间序列筛选人进入高原后的差异基因和差异甲基化位点

人体进入高原低氧环境后在分子水平的变化尚不清楚。本研究首次利用GEO数据库中21位健康志愿者进入高原前后7个时间点的转录组和DNA甲基化数据,筛选进入高原后多个时间点和整个时间序列中的差异基因和差异甲基化位点。基于单个时间点分析,18个基因的表达水平、114个甲基化位点的甲基化水平在进入高原后的6个时间点均显著改变。基于时间序列分析,得到差异基因集(778个基因)并聚类形成4个动态变化簇,对4个变化簇分别进行GO富集得到RNA修饰、中性粒细胞活化、组蛋白修饰、细胞有丝分裂调控等信号通路;得到差异甲基化位点集(599个甲基化位点)并聚类形成4个动态变化簇,对4个变化簇分别进行GO富集得到淋巴细胞分化、骨骼系统形态等信号通路。对差异基因集和甲基化位点集进行相关性分析得到17个甲基化位点的甲基化水平与其对应的基因表达水平显著相关。综合单个时间点和时间序列分析,10个基因(CD83、CXCL8、DCUN1D4、DDX5、FOS、G0S2、PTGS2、RGS1、RGS2和RNU11)的表达水平、7个甲基化位点(cg22245494、cg18652852、cg00488501、cg15720547、cg02989669、cg09831207和cg07961632)的甲基化水平在进入高原后的各时间点及整个时间序列中均显著变化。筛选出的差异基因和差异甲基化位点可能在人体进入高原低氧环境后发挥重要作用,其潜在的生物学机制还需进一步验证。