瑞香素对恶性疟原虫细胞色素C氧化酶及核糖核酸还原酶活性的影响

目的体外测定瑞香素对恶性疟原虫细胞色素C氧化酶(COX)及核糖核酸还原酶(RNR)活性的影响。方法Trager&Jensen法体外培养恶性疟原虫FCC1/HN分离株,超声波破碎恶性疟原虫提取总蛋白,用紫外分光光度计检测瑞香素与瑞香素-Fe复合物在不同作用时间和不同作用浓度对恶性疟原虫COX活性的影响,以电子自旋共振法检测经瑞香素与瑞香素-Fe复合物作用1、2、3和4h后,恶性疟原虫酪氨酸(Tyr)自由基的量以反映恶性疟原虫RNR的活性。结果体外同步培养的恶性疟原虫经瑞香素(100μmol/L)作用2、4、8和12h后,COX活性分别被抑制了0、6%、73%和80%;在瑞香素浓度为0.1、1、100和1000μmol/L,作用6h后,COX活性分别被抑制3%、31%、53%和84%;而瑞香素-Fe复合物对COX的影响几乎消失。经瑞香素(100μmol/L)作用1、2、3和4h后RNR活性分别被抑制7%、51%、69%和75%;在瑞香素浓度为0.1、1、100和1000μmol/L,作用6h后,RNR活性分别被抑制3%、31%、58%和93%;而瑞香素-Fe复合物作用6h后RNR活性分别被抑制8%、6%、11%和9%。结论在体外瑞香素可显著降低恶性疟原虫的细胞色素C氧化酶(COX)及核糖核酸还原酶(RNR)活性。

实时荧光定量PCR测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫核糖核酸还原酶基因表达的影响

目的测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫核糖核酸还原酶（RNR）基因表达的影响。方法体外同步培养的恶性疟原虫经瑞香素及其衍生物DA78与DA79作用后,抽提总RNA,并合成相应的特异性引物,运用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫RNR基因表达的影响。结果恶性疟原虫体外经瑞香素及其衍生物作用后的RNR基因扩增标准曲线在10^5～10^9拷贝（copies）/ml范围内呈良好的线性关系,R^2为0.997 52;瑞香素及其衍生物DA78与DA79对恶性疟原虫RNR作用后,其原始拷贝数分别为81 173.23、124 830.83和74 801.35,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）,而瑞香素的铁螯合能力被饱和后,对该基因的表达未产生显著抑制（P〉0.01）。结论瑞香素类抗疟化合物体外抑制恶性疟原虫RNR的基因表达,RNR可能作为瑞香素类抗疟化合物抗疟作用的候选靶分子之一。

Notch信号通路基因JAG1、ADAM17和ADAM10与先天性心脏病(CHD)的相关性

目的探索Notch通路的配体JAG1和限速酶ADAM10和ADAM17与先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)发病的相关性。方法选取来自山东、上海两地的1 053例CHD患者血液样本和1 000例对照样本,对这3个基因的5′启动子区和3′-UTR区进行了全测序,并进行统计分析及简要功能验证。结果检测到7个SNP(含2个新发SNP位点Ch2:9695908T/C和Ch20:10655928T/C)和1个单倍型组合具有显著性频率差异。双荧光素酶报告基因试验表明其中ADAM17启动子区的rs3811592Mrs13415726Mrs3811591M这个连锁单倍型可显著下调基因表达;而JAG1启动子区的rs7264849M则可显著上调基因表达。结论这些SNP突变可能影响Notch信号的强弱,从而与心脏发育异常相关。

SHMT1基因启动子的rs638416位点与先天性心脏病的相关性

目的 通过研究丝氨酸羟甲基转移酶（serine hydroxy methyl transferase,SHMT1）基因启动子区的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）来探讨该基因与先天性心脏病 （congenital heart disease,CHD）的相关性。方法 选取来自山东省的201例CHD患儿（病例组）和192例正常儿童（对照组）,采用Sanger测序法对rs638416和rs117940726两个位点的基因分型进行病例-对照研究,进一步用双荧光素酶报告基因分析其是否为功能性SNP。结果 两个SNP位点的基因型分布在病例组和对照组中均符合Hardy-Weinberg平衡;单位点分析显示rs638416位点G等位基因在病例组中分布频率显著高于对照组 （P=0.009）。经非条件Logistic回归分析确定,Log-additive模型最适用于分析rs638416,且该模型下统计学差异最显著 （OR=1.49,95%CI：1.11- 2.01,P=0.007 4）;双荧光素酶报告基因分析显示带有G等位基因的启动子序列转录效率较带有C等位基因的启动子序列低36% （P=0.013）。结论 rs638416位点能影响SHMT1转录效率,并与心脏发育异常相关,提示rs638416位点G等位基因是山东人群CHD发生的遗传风险因子。

PARP9促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭

目的探究聚(ADP-核糖)聚合酶9[poly(ADP-ribose)polymerase 9,PARP9]在肺腺癌组织中的表达、预后及其对肺腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。方法通过UALCAN数据库、GEO数据库和72例配对肺腺癌组织样本的免疫组化染色结果,分析PARP9在肺腺癌组织中的表达、预后以及与肺腺癌患者临床病理特征的相关性。利用CRISPR/Cas9在肺腺癌细胞H1299和A549中敲除PARP9基因,通过慢病毒感染在PARP9缺陷的A549细胞中恢复表达PARP9,使用Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力的改变。结果数据库分析与免疫组化染色结果表明,与正常肺组织相比,PARP9在肺腺癌组织中的mRNA和蛋白质水平均显著提高(P<0.05)。PARP9高表达的肺腺癌患者总体生存期更短,且PARP9表达与肺腺癌患者的临床分期与淋巴结转移相关(P<0.05)。PARP9缺陷显著抑制H1299和A549细胞的迁移和侵袭能力,恢复表达PARP9可以逆转该表型(P<0.05)。结论PARP9在肺腺癌中高表达,高表达PARP9的肺腺癌患者预后不良,PARP9可促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭,提示其可能是肺腺癌的一个重要原癌基因。

表达抗原Rv1255c的重组卡介苗的免疫原性研究

目的 选取结核分枝杆菌RD10区抗原Rv1255c,构建重组卡介苗(rBCG::Rv1255c),评价其诱导先天性免疫和适应性免疫应答的能力。方法 通过分子克隆构建重组质粒pMV261-Rv1255c,将其电转进入BCG感受态细胞,通过蛋白印迹方法筛选得到表达Rv1255c的重组卡介苗;rBCG::Rv1255c腹腔免疫C57BL/6小鼠,在免疫后24 h和7 d,用ELISA、流式细胞术等方法检测吞噬细胞和淋巴细胞的比例、NO和H;O;的含量;rBCG::Rv1255c皮下免疫小鼠,在免疫后6周,用ELISA检测脾淋巴细胞分泌TNF-α、IFN-γ和IL-2的水平,用流式细胞术检测CD4;和CD8;T细胞分泌IFN-γ、IL-2的水平。结果 成功构建重组卡介苗rBCG::Rv1255c;腹腔免疫C57BL/6小鼠后,与BCG相比,rBCG::Rv1255c能够激活更强的先天性免疫应答,包括中性粒细胞数升高(P=0.000 1);NO(P=0.007 6,P<0.01;P<0.000 1)和H;O;(P=0.000 2,P<0.001;P=0.035 5,P<0.05)含量增加;同时rBCG::Rv1255c皮下免疫6周后的小鼠脾淋巴细胞针对特异抗原分泌更高水平的TNF-α(P<0.000 1)、IFN-γ(P=0.009 8,P<0.01)和IL-2(P=0.000 7,P<0.001),CD4;和CD8;T细胞分泌更高水平的IFN-γ(P=0.002 7,P<0.01)、IL-2(P=0.000 2,P<0.001;P=0.025 9,P<0.05)。这表明rBCG::Rv1255c可以更好地激活适应性免疫应答。结论 与BCG相比,rBCG::Rv1255c可以促进吞噬细胞的激活,增强TH1型细胞因子分泌,显示出良好的免疫原性,可作为潜在的抗结核疫苗进一步研究。