海分枝杆菌embA低表达菌株的构建及巨噬细胞侵染实验

通过CRISPRi基因编辑技术构建阿拉伯糖基转移酶基因A(embA)低表达海分枝杆菌突变株,利用qRT-PCR技术检测相关基因转录水平。突变株侵染巨噬细胞后,台盼蓝染色测定细胞存活率,稀释涂布法检测胞内活菌数量。免疫荧光染色观察感染后巨噬细胞中F-actin细胞骨架重排和吞噬小泡的形成。分别通过Western blot和细胞因子悬液芯片方法验证小鼠巨噬细胞J774A.1胞内髓样分化因子88(Myeloid Differenti-ation factor,MyD88)表达量和细胞因子分泌。结果显示:对数生长中期野生型海分枝杆菌中glfT2和embA基因表达量增加。embA低表达突变株中embB,glfT2等6个阿拉伯半乳聚糖合成基因显著下调,但菌体形态和长度不变。与对照菌株相比,突变株侵染J774A.1巨噬细胞24 h后,细胞存活率和胞内CFU上升,吞噬小泡和骨架蛋白无明显变化。胞内MyD88蛋白表达水平增加,分泌性炎症因子TNF-α、IL-6和趋化因子RANTES、MIP-1α水平上升。本研究提示,embA表达量下降会降低海分枝杆菌的细胞毒力,但不会直接改变巨噬细胞吞噬病原菌的生理过程。

自动量化食管胃肿瘤浸润淋巴细胞工具的开发与应用

目的:基于HE染色的食管胃肿瘤切片图像构建细胞特征训练集,自动量化切片中的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TILs),用以辅助预后研究。方法:纳入江苏泰兴214例食管胃交界处腺癌(adenocarcinoma of the esophagogastric junction,AEGJ)、256例胃腺癌(gastric adenocarcinoma,GAC)和752例食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)病例,由病理医师建立包含肿瘤细胞、基质细胞及淋巴细胞特征的训练集,并使用二折验证,单细胞注释与自动识别结果之间的相关性检验,自动评估的TILs与人工评估的TILs比例的趋势性检验来评估细胞识别准确性。使用Kaplan-Meier法和Cox等比例风险模型探索预后应用价值。结果:该工具识别食管胃肿瘤TILs的准确性至少达到90%。分类器与病理医师对AEGJ、GAC和ESCC定量评估的总体相关系数分别为0.92、0.93和0.93,TILs的相关系数分别为0.94、0.95和0.95。三种肿瘤的TILs比例自动识别结果与人工分级一致。预后应用显示TILs比例为食管胃肿瘤的独立预后标志物。结论:基于食管胃癌细胞特征训练集的TILs浸润度评估工具可用于TILs比例的准确评估,具有良好的预后应用前景。

拟南芥生态型Zu-0减少主茎分枝的遗传机理探究

植物分枝发育很大程度上决定了植物地上部的形态结构,在植物的形态建成中占有非常重要的地位.它又与作物的生物量和结实量有着密切的关系,是作物的重要农艺性状之一.以实验室常用拟南芥生态型Col-0和减少主茎分枝(RSB)的生态型Zu-0为亲本,构建了包含192个株系的重组自交系群体.利用分离群体分组分析法(BSA)检测出与RSB性状连锁的13个分子标记.最终初定位到4个减少主茎分枝的数量性状位点(QTL).qRSBZu-2和qRSBZu-3区域分别含有已知的同时控制开花时间和减少主茎分枝表型的FRI和FLC基因.qRSBZu-1和qRSBZu-4区域尽管含有已知分枝调控基因AGL6和CUC2,但AGL6和CUC2测序结果表明这2个基因在Col-0和Zu-0中没有编码氨基酸的改变,而且AGL6的表达量也没有改变,表明这2个位点还存在着其他基因参与了RSB性状的调控.构建杂合自交家系(HIF)群体,对qRSBZu-1和qRSBZu-4的真实性进行了验证.

棒状杆菌发酵基因工程研究进展

传统的育种方法由于本身的缺陷受到了基因工程育种的强有力挑战,基因工程技术应用于发酵工业创立了全新的发酵基因工程。传统发酵菌种棒状杆菌的分子生物学研究欣欣向荣,棒状杆菌的受体系统、载体系统以及DNA转移技术都已取得长足进展。对棒状杆菌的分子遗传机制的阐明使得构建表达载体并表达目的基因成为现实。利用基因突变和基因重组技术选育优良的棒状杆菌发酵菌种,业已取得明显成效。

卵巢黏液性癌的诊治进展

卵巢黏液性癌(mucinous ovarian cancer,MOC)是卵巢上皮性癌的一种罕见病理学类型,临床上治疗多参考卵巢浆液性癌(serous ovarian cancer,SOC)的相关指南,但由于MOC的临床病理学特征和分子生物学特征与SOC显著不同,因此诊断和治疗均需仔细鉴别。手术联合辅助化疗为目前治疗MOC的标准方案,但由于其患病率低,临床试验难以开展,循证医学证据缺乏,术中阑尾切除指征、术后辅助化疗方案的选择等均缺乏共识。此外,还需进一步转化靶向治疗和免疫治疗的临床前研究,以利于MOC的精准诊断及个体化治疗。

穿梭表达载体的构建及产L-苯丙氨酸基因工程菌的选育

基因工程技术已经给发酵工程的发展注入了新的活力,使传统的发酵工业面貌一新。它不仅开创了许许多多新的发酵产品,而且也使不少传统发酵产品的产量、质量和生产技术有了新的飞跃。棒状杆菌中许多菌(如,谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌)是重要的工业生产菌。这类菌生长迅速、不产胞外蛋白酶、无内毒素、产品易分离纯化,已广泛用于各种氨基酸、核苷酸等的发酵生产。因此开展棒状杆菌的基因工程研究具有重要的理论意义和应用价值。

遗传病的基因治疗研究

遗传病的种类已不下4700余种,全世界患者有几百万人,患者除本身受到折磨外,还会把缺陷基因遗传给后代,给社会和家庭带来更多更大的悲剧。因此多年来一直在探索采用基因治疗手段去根治遗传病。经过20年的技术发展,遗传病的体细胞基因治疗已从实验室研究走向临床,并取得了初步成效。血友病B是10来种最适合用于研究体细胞基因治疗的病种之一,因为它的致病基因小,遗传规律清楚,调控又不那么要求精确。

温州乐清湾三个泥蚶群体遗传多样性的初步研究

采用形态判别分析和RAPD分析相结合的方法,对温州乐清湾地区三个泥蚶群体:乐清湾泥蚶,福建泥蚶,和韩国泥蚶三个群体的遗传多样性进行了初步的分析。结果表明:(1)在分子水平上,乐清湾泥蚶群体与韩国群体的亲源关系最为接近,而与地理位置更为接近的福建群体亲缘关系较远。(2)根据形态判别分析,乐清湾泥蚶群体与福建泥蚶群体亲缘最近,而与韩国较远。(3)韩国泥蚶群体的遗传多样性最高,乐清湾泥蚶群体次之,福建泥蚶群体最低。三者的平均遗传杂合度和群体内的遗传距离分别为0.275 4和0.304 8,0.257 5和0.240 1,以及0.247 3和0.211 5,但总体来说,三者的遗传多样性都保持比较高的水平。(4)随机引物S.418,S.359和S.431扩增的结果有乐清湾泥蚶群体特有的条带,其可以作为区分乐清湾泥蚶与其它两种泥蚶的分子标记。

单基因遗传病无创产前检测的研究与展望

21/18/13三体的无创性产前检测(noninvasive prenatal testing,NIPT)近年来在临床上得到了广泛的应用,在唐氏综合征等遗传病的预防中发挥了重要作用。单基因遗传病种类多,危害大,涉及的基因突变也很复杂,单基因遗传病的NIPT需要检测特异基因缺陷,因而需要更高的技术灵敏度和特异性,近年来一直是国内外研究的难点和热点。单基因病的NIPT主要将单基因突变转化为单体型分析来提高突变分析灵敏度,以及直接对孕妇外周血胎儿基因突变进行精确定量的策略。该文对NIPT的发展,特别是单基因病的NIPT方面的研究进行了总结回顾,并对NIPT技术的应用进行了拓展。

水稻抗真菌(稻瘟病)的基因工程

稻瘟病是水稻的重要病害之一，严重时产量损失在47％左右，Collinge认为植物可能没有免疫系统，防止病原菌能力较弱。而植物在漫长的进化过程中，为了抵抗病原菌侵入，形成了一系列的防卫系统，这些防卫系统会对植物生活周期中遇到的病原菌攻击信号做出相应的反应。其中一个研究最为清楚的是防卫表达蛋白或称病原相关蛋白（Patnogenesis—related protein而称PR蛋白）。

拟南芥叶片衰老前后叶绿素降解代谢基因表达和酶积累的模式及其影响因素分析

由叶绿素降解引起的叶片衰老褪绿不仅是植物衰老最直观的性状,还是植物进行营养动员的关键事件。近年来,进入衰老窗口(senescence window)后的叶片中叶绿素降解代谢酶基因(Chl catabolic genes,CCGs)的表达调控已经得到了较为充分的研究,但在未衰老叶片中对CCGs表达模式的研究还鲜见报道。本研究中,我们分析了主要叶绿素降解代谢酶(Chl Catabolic Enzymes,CCEs)及其编码基因CCGs在自然衰老以及未衰老的拟南芥叶片中的表达模式。研究结果显示,在叶片自然衰老过程中,CCGs剧烈上调表达且CCEs蛋白逐渐累积,以催化衰老细胞中叶绿素的大量降解;值得注意的是,在长日照培养条件下,未衰老叶片中CCGs的表达存在显著的波动,其表达量在光照开启后开始上升,10:00~16:00之间达到峰值后逐渐下降。我们的分析显示,CCGs表达量的波动很有可能是光-暗交替导致的,与CCA1介导的节律信号没有明显的相关性。我们的研究结果提示,外界光信号对未衰老叶片中CCGs的表达调控起至关重要的作用。

内质网应激通过不依赖脂质从头合成的通路诱导非酒精性脂肪肝病

内质网应激对代谢状态失衡具有重要影响。近年来研究人员发现内质网应激可以诱导小鼠非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的发生发展。但是内质网应激引发肝脏脂肪堆积的机制尚不完全清楚。二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT1)是催化甘油三酯合成的关键酶之一,对肝脏脂质合成具有重要意义。在此前的研究中,尚未有人报道过DGAT1在内质网应激诱导NAFLD中的作用。在本研究中,我们通过给小鼠腹腔注射衣霉素,成功诱导了小鼠肝脏内质网应激,发现衣霉素处理的小鼠肝脏有更高的甘油三脂含量并出现较为明显的脂滴堆积。然而,转录水平的检测结果显示该应激并没有上调脂质从头合成关键基因在肝脏中的表达,反而是下调了这些基因的表达。进一步分析发现内质网应激导致小鼠肝脏游离脂肪酸含量显著升高,同时引起肝脏DGAT1表达上调,但并不影响DGAT2的表达。综上,我们的结果表明衣霉素诱导的内质网应激并非通过引发肝脏脂质的从头合成导致肝脏脂肪堆积,而是通过上调肝脏脂肪酸含量以及提高DGAT1的表达,从而促进甘油三酯的合成,导致肝脏脂滴堆积。

非高密度脂蛋白-胆固醇和TC/HDL-C比值与肿瘤发病风险的关联分析

目的:探究非高密度脂蛋白-胆固醇(non-high-density lipoprotein-cholesterol,non-HDL-C)和总胆固醇/高密度脂蛋白胆固醇(TC/HDL-C)比值与恶性肿瘤发病风险的关联,以评估其在肿瘤预防中的价值。方法:数据来源于2016年04月至2017年11月在上海松江区部分社区开展的自然人群队列。研究人群为20~74岁常住居民,并完成了问卷调查、体格检查和血液和尿液生化检测。采用Cox等比例风险回归模型和限制性立方样条函数估计non-HDL-C和TC/HDL-C比值水平与恶性肿瘤的关联及剂量-反应关系。结果:研究共纳入33414名研究对象,中位随访时间为4.88年,新发肿瘤病例911例。non-HDL-C水平与肿瘤发病风险呈负相关,1-SD增量non-HDL-C水平降低9%肿瘤发病风险。TC/HDL-C比值为2.03~2.97者的肿瘤发病风险增加。在男性和既往无糖尿病病史人群中均显示non-HDL-C的Q4水平组肿瘤发病风险低于Q1组[HR(95%CI)=0.74(0.56,0.99),HR(95%CI)=0.79(0.64,0.98)]。结论:non-HDL-C水平与恶性肿瘤发病风险有关,是潜在的可改变的肿瘤危险因素。

水稻成花素基因Hd3a在ABA调控种子萌发中的功能研究

Hd3a(Heading date 3a)是拟南芥成花素基因FT(Flowering Locus T)的同源基因,作为水稻开花的强诱导因子,对短日照条件下水稻的开花具有重要的促进作用。Hd3a在水稻发育中是否具有其他功能,目前的认识仍非常有限。在我们的研究中,通过对Hd3a基因组序列进行生物信息学分析,发现Hd3a的启动子序列包含响应脱落酸(Abscisic Acid,ABA)信号的ABRE(ABA-Responsive Element)元件。荧光素酶发光反应和RT-qPCR分析都证实了Hd3a的转录表达随外源ABA增加而减少。通过不同浓度的ABA处理水稻野生型和hd3a缺失突变体种子,结果表明hd3a缺失突变体种子萌发明显被抑制,暗示了Hd3a缺失导致种子萌发中对ABA敏感性增强,同时hd3a突变体中ABA信号途径响应基因ABI5(ABA Insensitive 5)、ABL1(ABI5-Like1)的表达量升高,表明Hd3a可负调控ABA信号。综上所述,Hd3a可以响应ABA信号调控水稻种子萌发,这些研究结果对于深入理解水稻Hd3a基因的生物学功能具有重要意义。

基于数据库挖掘皮肤黑色素瘤微环境预后生物标志物

目的 通过探索肿瘤微环境(TME)来确定与皮肤黑色素瘤(SKCM)预后生存相关基因,并进一步构建评估SKCM患者预后的风险预测模型。方法 根据癌症基因组图谱(TCGA)数据库和ESTIMATE算法计算SKCM患者的免疫评分和基质评分,筛选高分组与低分组之间的差异表达基因(DEG),并进一步通过功能富集分析、蛋白质相互作用网络(PPI)、生存分析和Lasso回归分析筛选预后显著相关基因,最终利用预后显著相关基因构建风险预测模型。结果 471例SKCM病例纳入本研究,根据免疫评分和基质评分的中位数,将236例评分≥中位数的患者纳入高分组,235例评分<中位数的患者纳入低分组。高免疫评分组和高基质评分组的中位生存时间分别显著长于低免疫评分组和低基质评分组(P值均<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线显示,免疫评分、基质评分均与SKCM患者的生存时间呈正相关(P=0.000 11、0.046)。SKCM患者中高分组和低分组的基因表达数据分析结果显示,高分组和低分组具有不同的基因表达谱。基于免疫评分的结果显示,高分组有1 257个基因上调,20个基因下调[log2差异倍数(|log2(FC)|>1.5),P<0.05];基于基质评分的结果显示,高分组有876个基因上调,42个基因下调[|log2(FC)|>1.5,P<0.05]。免疫评分和基质评分进行基因集富集分析(GSEA),结果显示上调基因主要富集的基因组百科全书(KEGG)通路为细胞因子-细胞因子受体的相互作用、趋化因子信号传导途径、NF-κB信号传导途径等,基因本体(GO)通路为免疫学突触、细胞因子产生的负向调节和正向调节、细胞杀伤等。韦恩图显示,有728个DEG在免疫评分和基质评分的高分组中表达上调,3个DEG在免疫评分和基质评分的高分组中表达下调,即一共731个基于不同评分筛选出的共有DEG。对731个共有DEG进行功能富集分析,结果显示共有DEG与免疫应答具有相关性;生存分析显示,共有599个(81.9%)基因的表达情况与SKCM患者的预后相关,其中596个(81.5%)基因的高表达与SKCM患者更好的预后相关(P<0.05),3个(0.4%)基因的低表达与SKCM患者更好的预后相关(P<0.05)。通过Lasso回归进一步筛选出29个候选基因,利用29个候选基因计算风险评分,并且根据风险评分将SKCM患者分为高风险组(评分≥中位数)和低风险组(评分<中位数);结果显示,低风险组的中位生存时间显著长于高风险组(P<0.000 1),且AUC达到0.66。结论 探索SKCM患者的TME确定了29个SKCM预后相关基因,构建的风险预测模型可用于评估患者生存情况。

腌制食品中降解亚硝酸盐的乳酸菌分离与鉴定

从多种传统腌制蔬菜中分离到12株乳酸菌,对它们的16S核糖体基因进行扩增测序,根据序列的同源性鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。对其生化特征以及亚硝酸盐耐受性和降解能力进行了研究和比较,最终筛选出1株各项指标优良,且能快速降解亚硝酸盐的植物乳杆菌J-10,该菌降解亚硝酸钠的最适温度为37℃,最适pH值为6.2,在添加0.25 mg/mL的亚硝酸钠的培养液中培养24h后,亚硝酸盐降解率为99.2%。

六价铬还原细菌Bacillus cereus S5.4还原机理及酶学性质研究

从宝钢电镀污泥中分离得到1株六价铬还原细菌Bacillus cereus S5.4,在液体LB培养基中培养72 h完全还原2 mmol/LCr^6＋.测定该菌株六价铬还原后细胞内外六价铬和总铬浓度,检测细胞各组分六价铬还原能力,并结合扫描电镜分析六价铬还原前后细胞形态的变化.结果表明,细菌的细胞壁膜能阻止六价铬进入细胞,是六价铬发生还原的主要场所,其通透性的改变将影响六价铬还原酶的作用;该菌株六价铬还原酶为非分泌型,在细菌细胞内侧发生作用.测定六价铬还原酶活性和稳定性：其最适温度范围25-37℃,最适pH 7,Cu^2＋有增强六价铬还原酶活性的作用;在37℃,该菌株六价铬还原酶Km为125.61μmol/L,Vmax为7.68 nmol/（min·mg）.

生物芯片技术及在中药研究中的应用展望

生物芯片是近几年来发展起来的一种尖端技术 ,可用于中药药理的分析、新药的研制开发、中药鉴定、毒理观察等方面 ,有利于在分子生物学水平上阐明中医药治病的机制 ,促进中药的现代化 。

杂交水稻及其“三系”线粒体DNA的AP-PCR指纹图谱

为了研究水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）细胞质雄性不育（ＣＭＳ）与线粒体基因组的关系，应用ＡＰ－ＰＣＲ 分析，用７ 个任意单引物对６ 种水稻品系线粒体ＤＮＡ 进行了扩增。水稻线粒体ＤＮＡ 的ＡＰ－ＰＣＲ 产物可分为三种类型：（１）所有供试品系均能扩增的片段，它们代表了线粒体ＤＮＡ 在进化上的保守性序列。有４ 个引物检测到这类片段。（２）２ 个以上水稻品系共同出现而在全部供试材料间存在差异的扩增片段，这类片段是检测水稻线粒体ＤＮＡ多态性的主要来源。（３）一种细胞质类型所特有的扩增片段，从引物Ｒ２ 和Ｖ５ 的扩增产物中发现了这类片段，它们可能与ＣＭＳ有关联。另外，ＷＡ型不育系珍汕９７Ａ 与其杂种之间在６ 个引物的扩增图谱上均存在不同程度的差异。

交河故城古车师人的线粒体DNA分析

从距今 2 0 0 0～ 2 5 0 0年左右的交河故城古代人骨中提取古 DNA,用 4对重叠引物对线粒体基因组的调控区 (3 63 bp)进行了扩增及测序 .线粒体基因组编码区的扩增片段用于限制性片段多样性分析 .结果显示4个个体中具有 3个 DNA序列 ,其中来自不同墓穴的两个个体的序列相同 ,说明这两者间有密切的母系遗传关系 .系统发育分析表明古车师的这 4个个体分散分布在现代新疆维吾尔人的序列之中 .从这些结果可以初步得出结论 ,即古车师人群并不是一个同源群体 ,在早期铁器时代 。