人C2H2型锌指蛋白基因ZNF194全长cDNA的克隆

用一个含有锌指编码序列的人cDNA片段(L2～9)作为探针杂交筛选人肝组织cDNA分子库,得到8个杂交阳性克隆,经测序和拼接后,将其整合为一条长1838bp的cDNA序列.该序列的221～1642bp为一个完整的开放阅读框,编码了一个由473个氨基酸组成的蛋白质,1～220 bp为5’-UTR,1643～1838 bp为3’-UTR,在1801～1806bp有一个加尾信号序列AATAAA,3’端为18 bp的polyA.编码蛋白质已被HGMW命名为ZNF194.全长cDNA在GenBank登录为No.U95044.ZNF194蛋白的N端有一个KRAB-A box,C端含10个C_2H_2型锌指结构.该基因呈泛在性表达,经用FISH方法定位,结果显示它位于染色体19q13.3～13.

人类“锌指”蛋白基因ZNF191 cDNA的分离与克隆

“锌指”蛋白是一类调控基因表达的转录因子,它们与特定的DNA序列(如启动子)结合而激活或抑制基因的转录;还能与单链DNA和RNA结合,或与有关蛋白质相互作用参与细胞分化,配子形成以及胚胎发育.近年来,人们还发现“锌指”蛋白基因突变与多种恶性肿瘤的发生密切相关.例如,易位突变的人体锌指基因WT-1和LAZ3可分别导致Wilm氏瘤和淋巴癌的发生;陈竺等发现染色体易位点上t(11;17)的一个“锌指”基因PLZF与维甲酸受体a基因RARa的融合导致急性早幼粒细胞性白血病.因此,分离和克隆新的锌指基因并探讨其生物学功能是十分有意义的课题.本文报道克隆一个新的人“锌指”蛋白cDNA.它在GenBank数据库的注册号是U68536,国际HGMW命名委员会将其命名为ZNF191基因.

重组溶葡萄球菌酶中宿主菌残余蛋白含量的测定

制备球形芽孢杆菌菌体蛋白作为免疫抗原,免疫家兔制备抗血清,建立了一种测定重组溶葡萄球菌酶中残余宿主菌菌体蛋白含量的双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA法快速、简便、灵敏,检测范围宽,能检测出制品中的微量菌体蛋白;对3批重组溶葡萄球菌酶原液的检测合格,制品中残余宿主菌蛋白含量小于万分之二。此方法可以用于重组溶葡萄球菌酶中残余宿主菌菌体蛋白含量的测定。

人类核糖体S6激酶RPS6KA5的cDNA克隆及组织表达谱分析

人类核糖体S6激酶包括两个蛋白家族P90^(RSK)和P70^(S6K),它们分别介导着两条细胞信号传导通路。当这些激酶活性被它们的抗体或纳巴霉素抑制时,细胞的增殖随之停止。但当纳巴霉素的结构类似物—免疫抑制剂FK-506作用于细胞时,虽可抑制成纤维细胞PBL1的增殖,但却不能抑制P90^(RSK)、P70^(S6K)和MAPK的活性。这提示体内还存在着已知P90^(RSK)和P70^(S6K)蛋白的替代者或还存在着不涉及已知P90^(RSK)和P70^(S6K)的信号通路。为此,本文采用“同源筛选”策略,试图证实上述推测。我们以小鼠P90^(RSK)基因的保守性序列为探针,在NCBI EST数据库中进行同源筛选,得到三个人体同源EST片段。以EST片段的整合序列为探针,在人脑组织cDNA文库中进行杂交筛选,最终获得3833bp的全长cDNA序列,其中第165-2570bp为一完整的开放阅读框,编码了802个氨基酸。这个推导蛋白质与人P90^(RSK)家族成员具有较高的氨基酸同源性,并被命名为RPS6KA5,它在国际GenBank的登录号为:AF090421,Northern杂交显示该基因在人各组织中广泛表达,RH定位将该基因定于14号染色体长臂31—32.1的范围内,另一新的P70^(S6K)基因(GenBank注册登记号为AF037447)也已被克隆,从而证实了人体内存在着已知P90^(RSK)及P70^(S6K)家族基因替代者的最初设想。

人源溶菌酶基因LYZL4在毕赤酵母中的重组表达及活性测定

LYZL4是本实验室克隆的一种c型人溶菌酶基因,根据毕赤酵母密码子偏爱性对LYZL4基因进行优化设计,优化后的基因克隆至具有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的pPIC9K载体中。通过电转化方法整合到甲醇营养型毕赤酵母表达菌株GS115基因组上,再利用不同浓度梯度的G418抗性YPD固体培养基筛选高拷贝转化子,经摇瓶发酵后,其上清液在SDS-PAGE胶上14.4 kDa处出现明显的蛋白条带,该蛋白条带经质谱鉴定证实是人LYZL4蛋白。以人溶菌酶(164 071U/mg)作为标准品,使用艳红微球菌作为底物,通过比色法测定重组LYZL4溶菌酶蛋白的活性,结果显示重组人溶菌酶LYZL4蛋白具有明显的溶菌活性,其酶活力可达38893U/ml。

人LYC5溶菌酶基因在毕赤酵母中的重组表达

LYC5是一种c型人溶菌酶蛋白。根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对LYC5的mRNA编码序列进行优化设计,将优化后的基因序列克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重组酵母表达质粒pPIC9K-LYC5。重组质粒经线性化处理后转化毕赤酵母GS115,应用G418抗性筛选出高拷贝转化子,并对其进行摇瓶诱导表达,产物经SDS-PAGE电泳检测,发现在约15 kDa的位置出现了一条特异蛋白条带,此条带经LTQ Orbitra pelite MS鉴定,证明此蛋白即LYC5溶菌酶蛋白,表达量约为20 mg/L。对表达上清液进行活性分析,发现表达上清对溶壁微球菌具有较好的溶菌活性,活性约为40 000 U/mg,最适酶活反应温度为45℃,最适pH为5.0。采用基因工程方法,首次表达出了有生物学活性的人源LYC5溶菌酶蛋白,为深入探讨人溶菌酶家族成员的抗菌谱及其应用前景的研究奠定了基础。