反义IGF-1 RNA基因治疗脑胶质瘤的实验研究

目的构建反义胰岛素样生长因子-1(IGF-1)表达质粒(pCEP4-IGF-1A)治疗大鼠C6脑胶质瘤。方法RT-PCR扩增300bpIGF-1cDNA,测序,构建反义IGF-1表达质粒,体外转染C6细胞,观察其体外增殖速率及对C6胶质瘤的治疗作用。结果反义IGF-1序列正确,反义IGF-1A转染的C6细胞生长明显受抑,体内成瘤性消失,荷瘤鼠肿瘤全部消失,6个月观察期内肿瘤无复发。结论反义IGF-1表达质粒能抑制C6细胞体外生长,体内杀伤肿瘤效果明显。

Ly49A 基因转染的淋巴细胞对H—2^d小鼠正常和肿瘤细胞杀伤活性的实验研究

目的 观察Ly49A基因转染的C5 7BL/ 6小鼠的淋巴细胞对BALB/c小鼠正常成纤维细胞和 4T1乳腺癌细胞杀伤能力的变化与差异。方法 构建逆转录病毒表达载体pLXSN Ly49A ,经由PA317包装细胞包装后转染C5 7BL/ 6小鼠淋巴细胞。流式细胞仪检测Ly49A受体在转染后淋巴细胞上的表达率。MTT法检测转染后淋巴细胞对BALB/c小鼠正常成纤维细胞和 4T1乳腺癌细胞的杀伤活性 ,以空载体转染和未转染的淋巴细胞作对照。结果 Ly49A基因转染的C5 7BL/ 6小鼠的淋巴细胞 2 4h后Ly49A受体表达率为 (4 6 .6 7± 0 .35 ) % ,空载体转染组为 (18.73± 0 .85 ) % ,未转染对照组为 (19.6 0± 0 .2 7) % ,其对BALB/c小鼠正常成纤维细胞的杀伤活性明显降低 (抑制率 2 2 %～ 2 5 % ) ,对 4T1乳腺癌细胞的杀伤活性无明显改变 (P >0 .0 5 )。结论 转染Ly49A的C5 7BL/ 6小鼠淋巴细胞对BALB/c小鼠正常细胞的杀伤作用明显降低 ,但仍保留了对肿瘤细胞的杀伤活性 。

啤酒污染乳酸菌PCR引物的设计

根据细菌 16srDNA序列的特点 ,通过对啤酒污染菌 16srDNA序列进行分析 ,设计合成了针对啤酒污染乳酸菌的引物。在 16srDNA基因水平证明了该引物对乳酸菌的特异性。该引物的特异性是PCR检测技术在啤酒厂推广应用的前提。同时反映了 16srDNA在微生物鉴定中所起的重要作用。

恶性疟原虫重组复合抗原的分离纯化及免疫活性鉴定

高效表达恶性疟原虫保护性抗原重组复合蛋白的工程菌ｐＷＲ－Ｃ／ＪＭ１０９和ｐＷＲ－ＣＡＣ／ＪＭ１０９，在发酵罐中发酵后收集菌体，经超声波破菌，硫酸铵分级沉淀，分子筛和离子交换层析等步骤纯化后，纯度可达８０％以上。纯化后的融会蛋白具有β－半乳糖苷酶的活力，用等电聚焦技术测定纯化蛋白的等电点分别为８．４和８．２５。用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法测定纯化蛋白的免疫原性，证实纯化的重组蛋白可与小鼠抗恶性疟原虫抗体以及疟区病人血清发生特异性免疫反应；重组蛋白免疫家兔后制备的抗血清可特异性地识别恶性疟原虫海南株和云南株的红内期抗原，说明我们纯化的融合蛋白为具有恶性疟原虫抗原活性的重组复合抗原。

恶性疟原虫杂合45肽抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的初步表达

将人工合成的恶性疟原虫杂合４５肽基因克隆到表达载体ｐＷＲ４５０－１中，获得了重组质粒ｐＷＲＡ。将ｐＷＲＡ先转化到ＬＢ５０００修饰后，再转化到ＳＬ３２６１，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲＡ）。ｐＷＲＡ在ＳＬ３２６１中以β－半乳糖膏苷酶－杂合多肽抗原Ａ融合蛋白质（ＧＺ－Ａ）形式表达，表达量约７．２％。从ＳＬ３２６１（ｐＷＲＡ）中纯化的ＧＺ－Ａ可与抗ＧＺ－Ａ抗体反应，滴度为１：３２．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示在ＧＺ－Ａ相应位置出现特异条带。上述结果初步说明ＳＬ３２６１表达的ＧＺ－Ａ具有抗原性。连续传代ＳＬ３２６１（ｐＷＲＡ）未见质粒丢失及明显的毒性，为恶性疟口服活疫苗的制备打下了基础。

恶性疟原虫杂合113肽抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261中的初步表达

我们先前已经将人工合成的恶性疟原虫杂合１１３肽基因克隆到表达载体ｐＷＲ４５０－１中，获得了重组质粒ｐＷＲＡＢ。现将ｎＷＲＡＢ先转化到ＬＢ５０００修饰后，再转化到疫苗菌ＳＬ３２６１，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲＡＢ）。ｐＷＲＡＢ在ＳＬ３２６１中以β－半乳糖苷酶一杂合多肽抗原ＡＢ融合蛋白（ＧＺ－Ａｍ形式表达，表达量约１３．３％。免疫双扩散发现从ＳＬ３２６１（ｐＷＲＡＢ）中纯化的ＧＺ－ＡＢ可与抗ＧＺ－ＡＢ抗体反应，滴度为１：１６。蛋白质印渍技术（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）显示在ＧＺ－ＡＢ相应位置处出现特异条带。上述结果初步说明ＳＬ３２６１表达的ＧＺ－ＡＢ具有抗原性。连续传代ＳＬ３２６１（ｐＷＲＡＢ）未见质粒ｐＷＲＡＢ丢失及明显的毒性，为恶性疟口服活疫苗的制备打下了基础。

结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B基因的克隆及表达

目的 对分支杆菌的一种分泌蛋白Ag85B的基因进行克隆、表达 ,为结核病进行诊断打下基础。 方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,以PCR法对基因ag85b进行扩增 ,产物与载体质粒 pET2 4b构建表达Ag85B的重组质粒 ,将此重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内 ,抽提质粒 ,酶切检验 ,再转化入表达宿主大肠杆菌JM 1 0 9(DE3)菌株内 ,对转化菌株以IPTG进行诱导后 ,破菌 ,离心 ,上清进行SDS PAGE电泳。结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有蛋白表达 ,所表达的蛋白质分相对分子质量为 30 0 0 0。结论 目的基因克隆入宿主菌内 ,重组结核杆菌分泌蛋白Ag85B的成功表达为进行临床诊断试验奠定了基础。