脓毒症患者外周血HMGB1、TLRs水平与应激性溃疡的相关性

目的探讨脓毒症患者外周血高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Toll样受体(TLRs)水平与应激性溃疡的相关性。方法回顾性分析2016年8月~2017年4月期间于笔者医院诊治的133例脓毒症患者并根据严重程度将其分为脓毒症组(62例)与严重脓毒症组(71例),根据是否发生应激性溃疡将其分为阳性组与阴性组,另以58例健康志愿者为对照组。实时荧光定量PCR法检测外周血HMGB1、Toll样受体2(TLR2)与Toll样受体4(TLR4)表达量,观察并比较阳性与阴性组患者血清前炎因子与氧化应激指标等。Logistic法分析影响脓毒症患者发生应激性溃疡的因素;受试者工作特征曲线(ROC)分析检测HMGB1、TLR2、TLR4对应激性溃疡的预测价值。结果脓毒症组患者外周血HMGB1、TLR2、TLR4水平均显著高于对照组(P=0.000、0.000、0.000),且严重脓毒症组显著高于脓毒症组(P=0.000、0.002、0.000),阳性组显著高于阴性组(P=0.000、0.000、0.000);与阴性组比较,阳性组IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、NO、MDA、hs-CRP、PCT水平及APACHEⅡ评分均显著升高(P=0.000、0.006、0.000、0.000、0.003、0.000、0.005、0.004、0.000、0.000、0.000),而SOD水平显著降低(P=0.000);Logistic分析显示脓毒症患者外周血HMGB1、TLR2与TLR4水平均为应激性溃疡的独立影响因素;ROC分析显示HMGB1、TLR2与TLR4的AUC分别为0.866、0.765、0.811。结论脓毒症患者外周血HMGB1、TLR2与TLR4水平升高可影响机体炎症及应激反应程度并导致应激性溃疡的发生,且均可为临床预测应激性溃疡的重要因子。

NLR、PLR对侵袭性念珠菌感染致重症脓毒症患者的诊断意义及预后价值

目的:探究淋巴细胞计数和外周血炎症细胞比值(中性粒细胞/淋巴细胞比值NLR及血小板/淋巴细胞比值PLR)在侵袭性念珠菌感染(ICI)脓毒症中的变化以及临床诊断价值,为临床评估患者预后和预防侵袭性念珠菌感染提供科学依据。方法:选取2018年1月至2020年6月在复旦大学附属上海市第五人民医院综合ICU诊断重症脓毒症227例患者为研究对象,其中侵袭性念珠菌感染患者27例,非侵袭性念珠菌感染患者200例。检测所有研究对象血常规参数以及G试验水平,计算NLR以及PLR值,检测IL-6,IL-8和TNF-α水平。采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析外周血炎症细胞比值对侵袭性念珠菌感染的诊断价值,采用COX分析影响侵袭性念珠菌感染重症脓毒症患者的预后因素。结果与非ICI组相比,ICI组患者、G实验、NLR以及PLR明显升高(P 【0.05),淋巴细胞计数、淋巴细胞比率和G试验 ≥ 52.60ng/L与侵袭性念珠菌感染密切相关。NLR诊断ICI的敏感性为62.2%,特异性为86.5%;PLR敏感度为76.5%,特异度为86.5%;G试验敏感度为89.5%,特异度为92.7%。年龄、糖尿病、APCCHE II评分、腹腔感染、NLR、PLR和淋巴细胞计数均是影响ICH患者预后的危险因素(HR = 2.685、3.627、1.691、2.153、2.967、2.067、1.82);多因素COX分析显示,NLR、PLR和淋巴细胞计数是影响ICI患者不良预后的独立危险因素(HR = 2.632、3.956、3.0163,P 【0.05),ICI患者27 d死亡12例(44.4%),存活15例。与预后良好者比较,预后不良者淋巴细胞计数水平降低,NLR和PLR升高,差异均有统计学意义(P 【0.05)。结论:侵袭性念珠菌感染重症脓毒症患者早期外周血参数中淋巴细胞计数和淋巴细胞比值(NLR, PLR)显著降低,作为一种源于全血细胞参数的炎症指标,对于侵袭性念珠菌感染的早期诊断具有一定的临床检测价值。

NLRP3炎性小体在白念珠菌脓毒症小鼠组织器官中的表达及作用

目的:研究NLRP3炎性小体信号通路相关分子在白念珠菌脓毒症小鼠重要组织器官中的表达情况,初步探讨NLRP3炎性小体在白念珠菌脓毒症免疫反应中的作用。方法:将C57BL/6小鼠分成对照组、脓毒症组(24 h, 48 h),经尾静脉注射白念珠菌建立白念珠菌脓毒症感染模型,在感染后的24 h、48 h处死小鼠并检测相关指标。取各组血液、肝、肺和肾组织匀浆在血平板上培养后检测其计数,ELISA法检测细胞因子IL-1β以及IL-18含量;qRT-PCR检测各组织匀浆中NLRP3、ASC、caspase-1中mRNA表达情况,Western blot及免疫荧光染色监测各组织NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达情况。结果:白念珠菌菌液(2.5*108 CFU/mL, 1 ml/10g)可导致小鼠发生白念珠菌脓毒症。与健康对照组相比,脓毒症组中的小鼠3种组织匀浆及血清中IL-1β、IL-18表达水平升高;与24 h组相比,3种组织匀浆中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、caspase-1 mRNA表达量在感染48 h后显著升高,并且肝脏和肾脏中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、caspase-1 mRNA在感染后24 h就显著升高;通过Western blot及免疫组化可见NLRP3、ASC、pro-casepase-1和caspase-1 p20蛋白水平也显著升高,不同组织中的阳性蛋白的表达量随感染时间而增加。与24 h组相比,在48 h组中,NLRP3蛋白在肝、肾、肺组织表达量显著升高(p β和IL-18的释放而发挥促炎作用。

共同感染对白色念珠菌感染状态的影响研究

目的研究致病大肠杆菌和白色念珠菌共同感染对白色念珠菌侵袭力和破坏性的影响。方法通过构建白色念珠菌和致病大肠杆菌共同感染离体肠上皮细胞（ Caco-2）的模型来研究共同感染对白色念珠菌感染状态的影响。通过倒置显微镜观察感染早期发生侵袭的白色念珠菌特征；通过测定乳酸脱氢酶（ LDH）活性评估上皮细胞被破坏程度；通过实时荧光定量PCR （ qRT-PCR）检测感染相关基因（ ALS3、 PLB1和SAP4）表达调控情况。采用SAS软件包进行数据统计分析。采用方差分析比较进行多组之间的比较，对于组间有差异的数据进一步采用Bonferroni法进行两两比较。以P＜0.05为差异具有统计学意义。结果显微镜观察发现共同感染组比单纯白色念珠菌感染组在感染早期更容易发生上皮细胞侵袭，侵袭的白色念珠菌呈簇状分布； LDH活性检测显示同时共同感染组（组3）最高（与组1、组2、组4、组5比较 F 值分别为14.48、5.48、11.74、3.45， P＜0.05），致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染组（组5）和单纯致病大肠杆菌感染组（组2）之间差异无统计学意义（F＝2.03， P＝0.54），白色念珠菌继发致病大肠杆菌感染组（组4）和单纯白色念珠菌感染组（组1）之间差异无统计学意义（F＝2.74， P＝0.11），组5、组2LDH活性值大于组1、组4（P＜0.05）；同时伴随白色念珠菌致病相关基因（PLB1和SAP4）上调， PLB1基因表达组3高于组1（ P ＝0.0143）， SAP4表达组3、组5高于组1（ P 值分别为0.0272、0.0018）。结论致病大肠杆菌和白色念珠菌共同感染增强了白色念珠菌的侵袭力和破坏性，并且增强的程度与两种菌的发病顺序和共存时间长短有关。

利用定量蛋白组学对脓毒症外周血单个核细胞差异蛋白的研究

目的 探讨基于数据非依赖性采集高分辨率色谱- 质谱技术（data independent acquisition liquid chromatography-mass spectrometry, DIA LC-MS）对于脓毒症外周血差异蛋白研究的可行性。方法 采用前瞻性研究，纳入2016 年4 月至2016 年7 月复旦大学附属上海市第五人民医院重症监护室（ICU）收治的10 例脓毒症以及10 例同时期入住ICU 年龄性别相仿的术后未并发脓毒症的患者（疾病对照组）。采用最新的数据非依赖性采集技术（data independent acquisition，DIA）联合skyline 数据提取软件对10 例脓毒症和10 例对照组的外周血单个核细胞的蛋白进行研究分析，所得的数据分别采用主成分分析法（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法- 判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）进行模式识别分析，确定外周血单个核细胞的差异蛋白，进行通路分析以及GO 分析。根据PLS-DA 模型变量的重要性投影（variable importance in the projection, VIP 值）初步筛选可能的蛋白标志物，并对贡献最大（VIP 〉1, P〈0.05）的3 个蛋白进行ELISA 验证和ROC 曲线的分析。结果 总共鉴定到了1 062 个碎片离子加和得到119 个差异蛋白，其中31 个蛋白上调，88 个蛋白下调。通过通路分析发现与碳代谢，血小板激活，细菌侵袭上皮，补体凝血瀑布激活有关。其中高迁移率蛋白1（HMGB-1），中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL），基质金属蛋白酶8（MMP-8）用ELISA 验证在脓毒症与疾病对照组的外周血单个核细胞表达中差异有统计学意义（P〈0.01）。ROC 曲线下面积均大于0.85，有较好的敏感度和特异度。结论 利用DIA-MS 技术对脓毒症外周血单个核细胞进行研究检测，PLS-DA、OPLS-DA、PCA 模式识别均能用于蛋白组学数据的分析，初步筛选HMGB-1、NGAL、MMP-8 是值得进一步研究的脓毒症外周血单个核细胞候选生物标志物。

肠缺血再灌注损伤后白色念珠菌深部侵袭研究

目的:研究大鼠肠道缺血再灌注损伤后白色念珠菌体内播散变化及机制。方法:大鼠分为5组:空白加假手术组、白色念珠菌感染加假手术组、缺血再灌注损伤组、白色念珠菌感染加缺血再灌注损伤组和头孢哌酮加缺血再灌注损伤组。在肠道缺血再灌注损伤术后5、24、48、72、96 h检测血液中白色念珠菌载量变化,并在96 h处死大鼠,检测肠壁、肠系膜淋巴结、肺、肾部位的白色念珠菌载量。同时检测白色念珠菌体内播散前后基因SAP1、SAP4表达变化。结果:①白色念珠菌感染加缺血再灌注损伤组血液中白色念珠菌载量在术后24 h达到最高峰(8.56×10~9 CFU/L),随后逐渐下降,但术后48 h又逐渐升高。白色念珠菌感染加假手术组在术后5 h即可检测到白色念珠菌,其载量随着术后时间延长逐渐下降。其余各对照组术后血液中几乎检测不到白色念珠菌。②术后96 h白色念珠菌感染加缺血再灌注损伤组大鼠各器官处白色念珠菌载量为:肺(1.60±0.32)×10^(8 )CFU/g,肾(1.22±0.29)×10~6 CFU/g,肠系膜淋巴结(8.41±1.44)×10~8 CFU/g,肠(1.13±0.37)×10^(11 )CFU/g。白色念珠菌感染加假手术组大鼠各器官处白色念珠菌载量为:肠系膜淋巴结(4.25±1.56)×10~8 CFU/g,小肠(6.23±1.58)×10~8 CFU/g,肺、肾部位均未检测到白色念珠菌。头孢哌酮加缺血再灌注损伤组仅能在小肠检测到白色念珠菌的存在:(2.73±0.48)×10^(4 )CFU/g,其余部位未检测到白色念珠菌。其他组各器官部位均未检测到白色念珠菌。在肠道缺血再灌注损伤后,侵袭血流的白色念珠菌表达基因SAP4增加。相反,在白色念珠菌突破肠黏膜屏障时基因SAP1的表达没有明显变化。结论:在肠道缺血再灌注损伤后,肠腔内大量定植的白色念珠菌易突破肠黏膜屏障侵袭入血引起念珠菌血症和系统性念珠菌病。基因SAP4在白色念珠菌体内播散时发挥重要作用。

白念珠菌酵母相-菌丝相形态转换机制的研究进展

白念珠菌是人体内重要的条件性致病真菌,形态多样性是其重要的生物学特征,不同形态细胞之间可相互转换。酵母相-菌丝相形态转换是白念珠菌中典型形态转换系统,与白念珠菌粘附、侵袭性等方面密切相关。宿主相关环境因素作用于白念珠菌,激活相应的信号传导通路,调控下游应答基因的表达,共同调控白念珠菌菌丝发育。结合目前关于白念珠菌形态转换的研究,认为广泛和深入的信号通路主要有:环磷酸腺苷/蛋白激酶A(c AMP/PKA)信号通路、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路、Rim101介导的p H信号通路和Tup1介导的负调控信号通路共同调控形态转换。该文将近年来国内外白念珠菌形态转换及其信号传导通路调控机制方面的进展进行综述分析。