泛素特异性修饰酶2-69对大鼠系膜细胞内饰胶蛋白聚糖表达和泛素化降解的调节

目的研究泛素特异性修饰酶2-69(USP2-69)对系膜细胞(MC)内饰胶蛋白聚糖(DCN)表达和泛素化的调节作用。方法 1培养MC细胞,采用Western blot法检测大鼠肾MC内USP2-69的表达;2采用免疫共沉淀、激光共聚焦和免疫荧光法,检测MC内USP2-69是否与DCN结合,并观察两者在MC内的定位;3将pRK5-USP2-69-HA质粒瞬时转染MC后,用Western blot法检测HA、USP2-69和DCN的蛋白表达,用免疫共沉淀法检测DCN的泛素化水平;4采用USP2-69siRNA处理MC,用PCR检测USP2-69和DCN的mRNA表达,用time-course Western blot法检测DCN的半衰期,Western blot法检测DCN的下游效应分子(TGF-β1和ColⅣ)的蛋白表达。结果 1 USP2-69在MC、肝细胞(BRL-3A)和足细胞(GEC)内均有表达,其在MC内的基础蛋白表达水平显著高于BRL-3A和GEC[MCs:(0.27±0.05),BRL-3A:(0.035±0.009),GEC:(0.012±0.004),P<0.01]。2 MC总蛋白经DCN抗体免疫沉淀后,可检测到USP2-69的表达;经USP2-69抗体免疫沉淀后,可检测到DCN表达;且在MC胞质内,代表USP2-69蛋白的荧光与代表DCN蛋白的荧光存在共定位。3转染pRK5-USP2-69-HA质粒的MC内可检测到代表外源性USP2-69表达的HA蛋白,USP2-69和DCN蛋白表达的升高,同时DCN的泛素化水平明显降低。4经USP2-69 RNA干扰的MC内DCN的mRNA水平没有明显改变,但其半衰期明显缩短(3 h),且TGF-β1和ColⅣ的蛋白表达均明显升高。结论大鼠肾MC内USP2-69可与DCN相结合,及两者在胞质内共定位,USP2-69能够降低MC内DCN的泛素化水平及提高DCN蛋白总量并促进其功能。

聚合酶链反应-芯片杂交法检测乙醛脱氢酶2亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性实验的体会

我国每年因药物不良反应的住院人数高达250万，死亡人数约20万。相关研究结果表明，药物不良反应占全球主要死亡原因的第4～6位。药物代谢相关的酶、药物结合相关的受体、药物转运相关的膜通道、信号传导相关蛋白的编码基因的遗传变异与药物不良反应密切相关[1]。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的脱氧核糖核酸序列多态性，是决定个体差异的最主要的遗传基础之一，SNP的存在导致生物个体之间大量功能蛋白不同，导致了对药物反应的千差万别[2，3]。而基因芯片技术对患者遗传分子诊断起着重要的作用。因此，规范的技术操作是保证基因芯片合格率的基础。