骨桥蛋白反义寡核苷酸抑制胃癌细胞MKN28粘附侵袭的实验研究

目的:骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种分泌型、粘附性的糖基化磷蛋白,许多肿瘤在发生发展过程中均伴有OPN的表达,而表达OPN的肿瘤也更易表现出侵袭、转移的倾向。本研究将观察OPN反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)抑制高分化人胃癌细胞株MKN28粘附侵袭的作用。方法:用脂质体将骨桥蛋白ASODN转染胃癌细胞MKN28,实验分3组,对照组、随机序列寡核苷酸(random oligonucleotide,rODN)组和ASODN组。通过荧光定量RT-PCR、免疫组化方法、粘附细胞计数法、穿透小室聚碳酸酯膜侵袭实验分别测定骨桥蛋白mRNA和细胞表面骨桥蛋白的蛋白表达及癌细胞粘附力、侵袭力的变化。结果:转染后ASODN组骨桥蛋白mRNA的相对定量比值较对照组显著降低(1.83±0.10vs.3.32±0.16,P<0.05);免疫组化检测骨桥蛋白表达结果显示,转染后荧光强度明显降低,细胞表面骨桥蛋白表达下降(P<0.01);转染后ASODN组粘附力和侵袭力均较对照组显著下降(粘附细胞百分数为20.50±4.58vs.41.50±8.40,穿透聚碳酸酯膜细胞数为21.80±6.90vs.42.00±9.40,P均小于0.01)。而rODN组上述各指标较对照组无明显变化。结论:骨桥蛋白的表达与粘附侵袭能力密切相关,反义寡核苷酸能有效抑制胃癌细胞株MKN28细胞骨桥蛋白基因的表达,从而抑制蛋白质的合成,降低其粘附侵袭能力。

抗原表位预测工具的研究与发展现状

适应性免疫在抗原识别和人体免疫过程中起到十分重要的作用。本文综述了抗原表位预测工具的研究进展及其在疫苗设计和免疫治疗策略中的应用,突出了其重要性。通过分析B细胞和T细胞抗原表位的识别机制,本文阐释了表位的种类及其在免疫反应中的作用。进一步详细讨论了B细胞和T细胞抗原表位的预测工具,特别是它们如何利用支持向量机、随机森林、深度学习等不同算法来解析表位信息,并介绍了当前该领域的最新发展现状。最后,本文对抗原表位预测技术的未来发展趋势进行了展望。

线粒体动力学在临床常见机体高能量代谢系统病变中作用的研究进展

线粒体作为机体内主要的能量提供细胞器,自身主要通过线粒体动力学,即融合和分裂过程以及线粒体自噬来维持平衡,功能异常的线粒体堆积会导致细胞凋亡和对能量代谢高度需求的组织器官损害。本文主要阐述线粒体动力学及其改变对于临床常见能量代谢相关疾病的影响。

肝细胞癌仑伐替尼耐药机制与新治疗策略

仑伐替尼是继索拉非尼之后FDA首次批准的晚期肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)一线用药,临床研究显示其疗效与索拉非尼相当,并在某些方面更具优势。然而,伴随仑伐替尼的大规模使用,近年来其临床耐药问题也引起高度关注。表皮生长因子受体(EGFR)激活、成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)过表达及HCC中肿瘤干细胞出现等为仑伐替尼耐药的重要原因。面对仑伐替尼耐药,一些创新性研究也取得了积极进展,如仑伐替尼联合免疫检查点抑制剂经临床试验证实具有良好疗效,成为新兴的HCC治疗策略。本文总结了近年关于仑伐替尼耐药机制及创新性应对策略的研究成果,为HCC患者进行仑伐替尼治疗提供新的参考。

体外诱导大鼠骨髓基质细胞向心肌细胞的分化

目的 通过体外诱导研究骨髓基质细胞 (MSC)向心肌样细胞的分化和心肌细胞特异性标志的表达。方法 抽取雄性SD大鼠骨髓 ,进行体外培养和连续传代 ,获得较纯的MSC。采用第 8代的MSC ,以去甲基化药物 5 氮杂胞苷进行体外诱导 ,相差显微镜下观察其形态变化 ,通过流式细胞仪 (FACS)分析细胞形态比例 ,以免疫组化方法鉴定心肌特征性蛋白Desmin和肌钙蛋白T(cTnT)表达 ,并通过RT PCR鉴定心肌特异因子基因的表达。结果 诱导前MSC多呈扁平多突起形态 ,诱导后形态发生变化 ,10d细胞呈长梭形 ,2 0d后细胞之间形成连接 ,排列方向渐趋一致 ,1月时出现肌管样结构。FACS检测发现诱导后MSC形态构成发生变化 ,以形态较小细胞为主。免疫组化检测Desmin阳性比例近 35 % ,有cTnT免疫荧光阳性细胞出现 ,约占 10 %。RT PCR显示诱导后MSC后有GATA 4、ANP和a MHC基因表达。结论 成体中的MSC在一定诱导条件下可以表现心肌样特征 。

硬皮病伴发肺间质病变小鼠模型的建立及发病机制研究

目的建立硬皮病伴发肺间质病变(systemic scleroderma associated with interstitial lung disease,SscILD)的小鼠动物模型,并初步探讨其发病机制。方法造模组以0.4 mg/mL浓度博来霉素(bleomycin,BLM)背部中央区域局部皮下注射0.1 mL/天,连续28天;对照组以PBS缓冲液(pH=7.4)相同方法处理;连续观察2组小鼠大体形态变化,以HE和Masson染色明确模型的可靠性,通过检测羟脯氨酸了解纤维化程度,并通过免疫组化检测TGF-β1、α-SMA、collagen-1、MMP-9、CD8+T细胞、CD68+巨噬细胞、IL-23的表述。结果造模组小鼠皮肤显著硬化,镜下真皮层显著增厚,胶原纤维束增多,排列紧密,胶原含量升高,符合硬皮病表现;并且肺组织出现明显炎症和纤维化,胶原含量显著升高,免疫组化检测发现TGF-β1、collagen-1、MMP-9、α-SMA、CD8+T细胞、CD68+巨噬细胞、IL-23的表达均显著性增高(P均<0.05)。结论 C3H/He小鼠连续28天皮下注射0.4 mg/mL的BLM能诱导Ssc-ILD动物模型,出现符合Ssc标准的皮肤改变,肺部出现明显的炎症和纤维化,与TGF-β1升高密切相关,并伴随α-SMA、collagen-1、MMP-9、CD8+T细胞、CD68+巨噬细胞、IL-23增多。

选择性COX-2抑制剂塞来昔布抑制B细胞淋巴瘤细胞株MDR-1及Bcl-2的mRNA表达并增强表柔比星的抗肿瘤作用

背景与目的:部分非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)具有高表达环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的特征,而后者与P-糖蛋白及Bcl-2表达相关,可能导致NHL对化疗耐药。本研究旨在探讨B细胞淋巴瘤细胞株中COX-2的表达以及选择性COX-2抑制剂塞来昔布增强淋巴瘤细胞对表柔比星抗肿瘤效应的敏感性及其可能机制。方法:用荧光定量PCR(q RT-PCR)及蛋白[质]印迹法(Western blot)分别检测Raji、Jeko-1和Namalwa等淋巴瘤细胞株以及正常人外周血B细胞的COX-2表达;以梯度浓度的塞来昔布作用于淋巴瘤细胞株,CCK-8方法检测细胞增殖的抑制程度,q RT-PCR检测各细胞株MDR-1 mRNA及Bcl-2 mRNA表达的变化;表柔比星单独或联合不同浓度的塞来昔布处理Raji细胞株72 h后,CCK-8方法分析塞来昔布对表柔比星的增敏作用。结果:各淋巴瘤细胞株及正常对照外周血B细胞均不表达COX-2。塞来昔布单药即可对各淋巴瘤细胞株产生程度不同的抗增殖效应;随着塞来昔布作用浓度的增加,除Jeko-1细胞不表达MDR-1外,其余细胞株MDR-1 mRNA及Bcl-2 mRNA表达水平逐渐下降;塞来昔布明显增强表柔比星对Raji细胞的抗肿瘤活性,两者之间具有协同作用。结论:选择性COX-2抑制剂塞来昔布下调B细胞淋巴瘤细胞株的MDR-1 mRNA及Bcl-2 mRNA水平,并且增强表柔比星对淋巴瘤细胞的抗肿瘤效应。

活细胞实时成像技术研究抗坏血酸(AA)协同砷剂抗人骨肉瘤MG-63的体外疗效

目的研究抗坏血酸(ascorbic acid,AA)和三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)抗人骨肉瘤细胞MG-63的体外疗效。方法以MG-63细胞为体外模型,用62.5μmol/L AA与1μmol/L As2O3单独或联合处理细胞,利用新型连续活细胞图像采集和分析平台(continuous live cell imaging and analysis platform,Cell IQ)实时观察细胞的生长情况和形态学的变化。结果 1μmol/L As2O3和62.5μmol/L AA单独处理都可抑制MG-63细胞的生长并诱导细胞死亡。1μmol/L As2O3和62.5μmol/L AA联合处理细胞较单独处理组细胞抑制效果更明显。结论 AA和AS2O3抗人骨肉瘤细胞Mg-63可起到协同作用,这一结果为临床治疗骨肉瘤提供了新的思路和实验依据。

人脐带动脉平滑肌细胞的培养及纯化

目的探讨血管平滑肌细胞培养和纯化的方法。方法用胎儿脐带动脉为材料,植块法原代培养人脐带动脉平滑肌细胞,传代过程中差异贴壁法纯化,相差显微镜观察培养细胞的形态,免疫组化染色检测细胞胞浆内α-肌动蛋白(α-actin)的表达。结果相差显微镜下观察细胞呈长梭形,生长致密时排列成相互平行的束状,未见明显异型细胞,α-actin胞浆染色阳性细胞数占总细胞数的99%以上。结论用胎儿脐带动脉为材料进行血管平滑肌细胞原代培养,传代过程中同时纯化的方法,简便可靠。

口服和经皮肤途径雌激素替代治疗对手术绝经妇女围绝经症状和T淋巴细胞雌激素受体亚型表达的影响

目的研究口服和经皮肤途径的雌激素替代治疗(ERT)对手术绝经妇女围绝经症状和T淋巴细胞雌激素受体(ER)亚型表达的影响。方法手术绝经妇女随机分为使用雌二醇口服片1 mg/d(口服组)和雌二醇贴片1.5 mg/w(皮贴组),用药3个月。评估用药前后围绝经症状、血雌二醇(E_2)和卵泡刺激素(FSH)水平,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测T淋巴细胞ERα、ERβ mRNA表达,免疫荧光法和免疫印迹法检测ERα、ERβ蛋白质表达。结果口服组和皮贴组用药后围绝经症状均明显改善,血清E_2水平明显升高,FSH水平明显降低,两组间无明显差异。两组用药后T淋巴细胞ERαmRNA和蛋白质表达均明显高于用药前,ERβ mRNA和蛋白质表达有增加趋势,两组间无明显差异。结论口服和经皮肤途径的ERT均能改善手术绝经妇女的围绝经症状,推测雌激素是通过与人T淋巴细胞ERα结合后影响绝经后的T淋巴细胞功能。

肺泡巨噬细胞亚型与急性肺损伤

巨噬细胞是机体固有免疫的重要组成部分,其亚型(M1和M2)在特异性免疫应答的诱导与调节以及疾病的发展和恢复中起关键作用。急性肺损伤(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是严重的呼吸系统疾病。在ALI中,M1增加并分泌促炎细胞因子,在抵御病原入侵的同时也对肺部产生了急性损伤作用。M2可根据诱导因素的不同及功能的差异再细分为M2a、M2b、M2c等亚型,其中M2a起促进损伤修复的作用,M2b和M2c主要起免疫调节和免疫抑制的作用,M2c也可促进组织修复,有利于肺部损伤组织的愈合。M1与M2可以相互转化。在ALI的病程中,M1和M2需要保持平衡才能有效地清除病原物质,促进损伤的修复,而平衡的失调会导致ALI恶化,甚至进展为ARDS。本文主要针对巨噬细胞各亚型的特点及其与ALI的关系,M1和M2各自的极化和相互转化以及影响各亚型在不同时期平衡的因素作一综述。

榄香烯预防胃癌HGC-27裸鼠腹腔转移的研究

目的:研究榄香烯对胃癌HGC-27裸鼠腹膜种植转移的预防作用。方法:建立人胃癌HGC-27腹膜转移裸鼠模型,分别给与榄香烯、顺铂(DDP)及两者联合进行干预后,检测腹膜转移瘤腹膜肿瘤指数,并用免疫组织化学法检测转移瘤组织中增殖细胞核抗原Ki67、抗凋亡蛋白bcl-2的蛋白表达情况。结果:与对照组比较,榄香烯、DDP及榄香烯联合DDP干预组的腹膜转移瘤PCI指数均显著降低,其中以联合治疗组PCI指数降低最为显著(PCI指数为33,P<0.01)。同时,上述3种干预组转移瘤组织中Ki67、bcl-2蛋白阳性表达率显著降低,其中以联合治疗组Ki67、bcl-2蛋白阳性表达率降低最为显著(57.14%和34.28%,均P<0.05)。结论:榄香烯单独或者联合DDP应用对于人胃癌HGC-27裸鼠腹腔转移有显著的预防作用。

G-CSF及胸腺肽α_1增加THP-1细胞对内毒素刺激的反应

目的观察粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及胸腺肽α1刺激后,人单核细胞株(THP-1)对内毒素刺激的反应及对Toll样受体4mRNA表达的影响。方法实验采用人THP-1细胞,以10、100及1 000ng/mL的G-CSF及胸腺肽α1分别刺激4h或24h。继而以10ng/mL内毒素刺激45min。以RT-PCR法扩增Toll样受体4(TLR4)mRNA。ELISA法测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以表示细胞对内毒素的反应。结果细胞经G-CSF及胸腺肽α1刺激后TLR4表达增加,细胞分泌TNF-α上升。随着G-CSF及胸腺肽α1刺激浓度的增加,TNF-α表达随之增加;刺激24h与4h比较,TNF-α表达也有增加。结论G-CSF及胸腺肽α1可刺激THP-1细胞TLR4mRNA表达,增加细胞对内毒素的反应,增加程度与G-CSF及胸腺肽α1刺激浓度及刺激时间呈正性相关。

流式细胞磁珠微阵列法检测血清中细胞因子水平在稳定期和急性加重期哮喘中的意义

目的探讨流式细胞磁珠微阵列法（cytometric beads array,CBA）检测血清中细胞因子水平在稳定期和急性加重期哮喘中的意义。方法纳入慢性持续期哮喘40例,急性发作期哮喘22例,健康人18例。抽取外周血2 mL,采用CAB法检测外周血清中细胞因子水平,并分析各细胞因子特征及与临床数据的相关性。全自动血细胞及生化仪检测血常规,C反应蛋白和降钙素原。结果定制含7种细胞因子微球（分别为IL-5,IL-6,IL-10,IL-13,IL-17,TNF-α,IFN-γ）的CBA试剂盒。与健康人相比,7种细胞因子在慢性持续期哮喘无明显改变。急性发作期哮喘细胞因子升高分为5种亚群,分别为IL-6升高型（22.8%）、IL-6/TNF-α双高型（13.6%）、IL-5升高型（31.8%）、IL-17升高型（占13.6%）及细胞因子正常型（占18.2%）。其中,IL-6、TNF-α明显升高,较健康人分别升高了6.28-12倍和17.3倍。IL-6升高型、IL-6/TNF-α升高型与白细胞及C反应蛋白呈正相关（R2=0.63,R2=0.67;P〈0.05）。结论 CBA法可快速检测哮喘血清标本的多种细胞因子水平,细胞因子在慢性持续期无明显升高,但IL-6、TNF-α、WBC和CRP的综合指标有助于判断由细菌感染诱发的急性加重,并快速指导抗生素的使用。

腺病毒介导白细胞介素-10基因转染抑制血管平滑肌细胞的增殖及机制

目的:观察白细胞介素(interleukin,IL)-10基因转染时血管平滑肌细胞增殖的影响,初步研究其相关机制。方法:不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)的IL-10重组腺病毒(Ad／IL-10)转染原代培养的人脐带动脉平滑肌细胞(HUASMCs),用酶联免疫吸附试验检测培养上清中IL-10的表达,噻唑蓝法测定吸光度值(OD570值),绘制细胞生长曲线,流式细胞术分析细胞周期、细胞凋亡,实时荧光定量聚合酶链反应检测p21的表达。结果:MOI=100时培养上清中IL-10含量最高．为5．746 ng／ml;转染72 h、96 h,MOI为100、150、200组与MOI为10、20组及空白对照组比较,显著抑制HUASMCs的增殖(P<0．01);与空白及空载体转染对照组比较,MOI 100的Ad／IL-10转染组的G0/1期细胞数、凋亡细胞的平均百分数均显著增加(P<0．01),p21基因表达的拷贝数较低。结论:MOI为100的Ad／IL-10可有效抑制HUA- SMCs的增殖,此作用与细胞周期阻滞和凋亡有关,为IL-10基因转染治疗血管内膜增生提供了理论依据。

诱导型一氧化氮合酶与移植血管平滑肌细胞增生的关系

目的 探讨诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)与移植血管平滑肌细胞增生的关系。方法 新西兰大白兔 15只随机分成 3组 ,建立双侧颈动脉间置移植颈外静脉的动物模型。高剂量组每日喂食L 精氨酸 (L Arg) 2 5 0mg/kg ,低剂量组每日喂食L Arg 12 5mg/kg ;对照组不喂食L Arg ,持续 2周。检测血浆和组织匀浆一氧化氮(NO)水平 ,移植血管iNOSmRNA表达。观察术后 3和 6周移植血管平滑肌细胞增生。结果 1.iNOS活性 :(1)血浆NO水平 :实验组血浆NO水平显著高于对照组 ,高剂量组血浆NO水平高于低剂量组 ;(2 )组织匀浆一氧化氮合酶 (NOS)活性 :实验组组织匀浆NOS活性显著高于对照组 ;(3)组织匀浆iNOSmRNA表达 :术后 3周实验组iNOSmRNA表达 ,对照组无表达 ;术后 6周实验组iNOSmRNA表达高于对照组 ,高剂量组高于低剂量组。 2 .移植血管平滑肌细胞形态学变化 :(1)SMA免疫组化染色 :实验组移植血管平滑肌细胞厚度低于对照组 ;术后 6周低剂量组移植血管平滑肌细胞厚度低于高剂量组 ;(2 )PCNA免疫组化染色 :术后 3周实验组平滑肌细胞增殖低于对照组 ;术后 6周低剂量组平滑肌细胞增殖低于对照组和高剂量组。结论 iNOS表达致体内NO水平增高可抑制移植血管平滑肌细胞增生 ;

携带TRAIL的溶瘤腺病毒治疗三阴性乳腺癌的研究

目的:构建携带肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-relatedapoptosis inducing ligand,TRAIL)基因的溶瘤腺病毒p55-hTERT-HRE-TRAIL,评估该病毒在体外和体内对三阴性乳腺癌的杀伤能力。方法:将质粒p55-hTERTHRE与pPE3-TRAIL通过Lipofectamine 2000共转染至人胚肾293细胞,获得溶瘤腺病毒p55-hTERT-HRE-TRAIL;采用病毒体外增殖实验观察乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人正常乳腺细胞株MCF-10A中的增殖情况;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法比较不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)的病毒对两种细胞的抑制效应;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测病毒感染细胞后上清液中TRAIL的含量,采用蛋白质印迹(Western blotting)法检测细胞内TRAIL蛋白的表达。建立三阴性乳腺癌的原位成瘤模型及左心室注射模拟转移瘤裸鼠模型,应用"活体内光学成像系统"动态观察肿瘤的生长及转移情况。结果:p55-hTERT-HRE-TRAIL感染乳腺癌细胞株后表现出强大的增殖、复制能力,而在人正常乳腺细胞株内增殖并不明显;很低浓度的p55-hTERT-HRE-TRAIL就对乳腺癌细胞产生明显的杀伤效应,而对正常乳腺细胞没有明显的杀伤作用;p55-hTERT-HRE-TRAIL感染乳腺癌细胞后,TRAIL蛋白的表达明显增多,而感染正常乳腺细胞后表达的TRAIL维持在较低的水平。乳腺癌原位成瘤模型中,空白对照组的光子数多于其他各组,肿瘤体积大于其他各组(P<0.05)。左心室注射模拟转移瘤模型中,对照组活体内光学成像与TRAIL治疗组差异有统计学意义,TRAIL治疗组的生存天数延长(P<0.05)。结论:成功构建高滴度的溶瘤腺病毒p55-hTERt-HRE-TRAIL,该病毒在乳腺癌细胞中具有特异性增殖并杀伤肿瘤细胞的能力。

肝癌MHCC97H细胞肝细胞生长因子(HGF)/c-Met通路激活对血管内皮生长因子表达的影响

目的:研究肝癌MHCC97H细胞中肝细胞生长因子(HGF)诱导血管内皮生长因子(VEGF)表达过程中的转录因子Sp1的活性。方法:将MHCC97H细胞分为对照组、HGF组、光辉霉素组,分别用RT-PCR及Western blot分析与VEGF mRNA、蛋白质表达及Sp1水平、磷酸化Sp1水平变化以及应用Sp1阻断剂光辉霉素后上述目标蛋白的变化情况。结果:外源性HGF60ng·mL-1孵育15min、16h后分别可以使MHCC97H细胞的VEGF mRNA及其蛋白质的表达明显提高(P<0.01)。这一过程中Sp1水平无明显变化(P>0.05)。进一步分析发现磷酸化Sp1水平明显升高(P<0.01)。用Sp1抑制剂光辉霉素预先处理MHCC97H细胞1h后,再加入HGF 60ng·mL-1 VEGFmRNA及其随后蛋白质表达均受到抑制(P<0.01)。结论:HGF诱导MHCC97H肝癌细胞VEGF表达是通过增强Sp1磷酸化实现的。

诱导骨髓基质细胞表达神经细胞标记物Nestin，NSE和GFAP：脑源性神经节苷脂定向诱导细胞分化作用的研究

目的：研究脑源性神经节苷脂诱导成年大鼠骨髓基质细胞定向分化为神经前体细胞的作用。方法：成年大鼠骨髓基质细胞传 代纯化后，分别在无血清、无外源性生长因子、含2%B27的 Neurobasal-A 培养基及含20%胎牛血清的 DMEM 培养基中添加脑源性 神经节苷脂作为诱导物，观察细胞的形态变化。结果：在无血清、无外源性生长因子、含2%1327的 Neurobasal-A 培养基中，脑源性神 经节苷脂能诱导骨髓基质细胞定向分化为神经前体细胞，其形态发生显著变化，胞体逐渐变小、折光性增强，突起逐渐增多、延长，部 分细胞间可见突起连接、细胞核和核仁；诱导第5 d 免疫细胞荧光染色显示，神经前体细胞标记物Nestin染色阳性，同时部分细胞可 见神经元特异性标记物 NSE 及星形胶质细胞标记物 GFAP 染色阳性，而少突胶质细胞标记物 Nogo-A 染色阴性。在含20%胎牛血 清的 DMEM(高糖)培养基中，脑源性神经节苷脂的这种诱导、分化作用明显被抑制，表现为细胞形态变化不明显，Nestin、NSE 及 GFAP 染色均为阴性。两组对照组细胞形态无变化、上述染色均为阴性。结论：脑源性神经节苷脂具有诱导骨髓基质细胞成为神经 前体细胞的作用，这种作用不需要外源性生长因子存在，血清可抑制这种作用，脑源性神经节苷脂在成体干细胞可塑性研究中有重要 价值。