复旦大学附属儿科医院高通量测序数据一体化全流程闭环分析系统及临床应用案例分析

背景目前的临床遗传诊断中,外显子组捕获测序(ES)和全基因组测序(WGS)均有广泛的应用场景且在综合性价比和变异检测范围等方面各有优势;建立支持两种不同建库策略测序方案的整合性遗传诊断流程,是进一步提高遗传诊断敏感性和检测效率的关键。目的整合ES以及WGS场景下的多变异类型分析、遗传病复杂临床表型的标准化与结构化、表型导向的遗传变异分析系统,建立从临床检测申请到遗传报告反馈的一体化流程。设计流程开发。方法(1)建立复旦大学附属儿科医院高通量测序数据一体化全流程闭环分析系统(复旦流程3.0)各个模块:①病史处理,②结构化遗传表型,③测序实验,④变异检测,⑤变异解读,⑥质控复核,⑦基因型表型联合分析。(2)代表性病例重测分析:根据结论性变异的类型和诊断难度选择代表性病例,展示代表性病例从病史处理开始到报告草稿为止各模块的运行情况。主要结局指标代表性病例分析过程中的结构化表型、数据质控、变异检测及解读、最终诊断。结果对3例代表性病例的重分析中,分别进行了经济版家系WGS、先证者WGS以及ES;病史成功提取结构化表型;FastQ及BAM文件结果数据质控良好;检测到的变异经解读之后进行基因型表型联合分析,分别检测出3例病例的复杂遗传模式。例1:ANTXR2基因点突变NM_058172:c.1294C>T与4q21.22约13 kb的结构变异缺失形成隐性纯合致病;例2:线粒体MT-ND6基因致病变异m.14459G>A,异质性>99.5%;例3:SMN1基因纯合致病变异NM_000344:c.863G>T合并SMN1基因单拷贝缺失。结论复旦流程3.0可整合ES和WGS数据,处理不同类型的变异结果,最终形成遗传诊断,且对复杂变异类型有高效处理能力。

身材矮小儿童523例病因分析

目的探讨身材矮小儿童的病因。方法矮小儿童共523例,其中男365例(69.79%),女158例(30.21%);平均年龄10.91岁。对其进行全面的病史采集和体格检查及相关实验室检查。结果生长激素缺乏症115例占21.99%;体质性青春发育延迟100例占19.12%;家族性矮小97例占18.55%;特发性矮小79例占15.11%,余为甲状腺功能减低症、宫内发育迟缓、Turner综合征、多种垂体激素缺乏症等引起的矮小症。结论矮小儿童中,内分泌疾病所致矮小占大多数,其中以生长激素缺乏症最为多见。对部分临床表现不典型的甲状腺功能减低症需通过实验室检查才能确诊。对矮小患儿应明确病因,给予对因治疗。

UGT1A1基因G71R突变与新生儿不明原因严重高胆红素血症相关

目的探讨尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）基因G71R突变与新生儿严重高胆红素血症的相关性.方法采用病例对照研究的方法,病例组为复旦大学附属儿科医院（我院）收治的不明原因严重高胆红素血症（血清总胆红素水平≥342μmol·L^-1）新生儿,采用PCR对外周血UGT1A1基因进行检测.对照组为我院新生儿出生缺陷生物样本数据库中血清总胆红素水平〈221μmol·L^-1病例.病例组及对照组新生儿均要求胎龄≥35周,出生体重≥2500g.结果病例组和对照组各65例.UGT1A1G71R是病例组中最常见的突变类型（73.8%,48/65）.对照组UGT1A1G71R突变位点与既往Meta分析中提取的中国健康新生儿对比,在基因型分布及等位基因频率上差异均无统计学意义（P〉005）.病例组和对照组UGT1A1基因G71R突变中A等位基因频率分别为0.5和0.15,差异有统计学意义（P〈0.001）,把握度为0.993.与携带G/G基因型新生儿相比,UGT1A1G71R突变（A/A＋G/A基因）可增加新生儿严重高胆红素血症的发病风险（OR=7.373,95%CI3.395～16.008）,把握度为1.0.结论UGT1A1基因G71R突变与新生儿不明原因严重高胆红素血症相关.

上海市6～18岁少儿肥胖患病率调查

目的 研究上海市 6～ 18岁年龄组的儿童青少年肥胖和超重患病率情况。 方法 采用整群系统抽样的方法随机抽取上海市区、郊区各一个区 ,普查区内所有中小学学生共 6 5 0 0 6名 (郊区 4 0 310名 ,市区 2 4 6 96名 )的身高、体重。以体质指数 (BMI)评价调查对象的肥胖患病率 ,并比较标化患病率的差异。 结果 (1)调查对象肥胖粗患病率为 3 5 8% ,超重标化患病率为 3 30 % ;超重粗患病率达 13 2 5 % ,标化患病率为 12 95 %。 (2 )总体上肥胖和超重的标化患病率市区显著高于郊区 (肥胖 :P <0 0 0 1,超重 :P <0 0 0 1) ;女性的发病率显著低于男性 (肥胖 :P <0 0 0 1,超重 :P <0 0 0 1)。 (3)肥胖和超重患病率随年龄增加显著减低 (P <0 0 0 1)。 结论 本组的肥胖患病率稍高于我国 1996年全国性调查的 0～ 7岁组儿童肥胖患病率 ,远低于美国上世纪 90年代末期的水平 ;各年龄组肥胖患病率随年龄增加而逐渐减低 ,与西方发达国家青少年肥胖患病率随年龄增加而增高的趋势有显著的不同。

超重肥胖青少年空腹血糖受损的特点及其相关影响因素分析

目的研究儿童青少年空腹血糖受损(IFG)的特点及其相关影响因素。方法超重肥胖组(Ob)459例,体重正常对照组(NC)221名,测量身高体重、FPG、FIns、瘦素及血脂,计算HO-MA-IR、HOMA-β、QUICKI,分析FPG的分布及相关因素。结果(1)Ob组的FIns、瘦素、血脂、HOMA-IR、HOMA-β显著高于NC组(P<0.05)。QUICKI显著低于NC组(P<0.05)。(2)在正常血糖组和IFG组,NC组的FIns显著低于Ob组(P<0.05)。(3)Ob组的IFG(17.21%)比例显著高于NC组(2.26%),NC组的IFG患者其FPG主要介于5.6～6.0mmol/L。FPG与年龄、性别、BMI、FIns、瘦素、TG、TC和HOMA-IR均显著相关。结论本组Ob患者IFG的发生率显著高于NC组,FPG与其他代谢综合征(MS)组分显著相关,进一步研究儿童青少年FPG和IFG变化规律,将有助于儿童青少年T2DM及相关MS的防治。

不同剂量生长激素治疗生长激素缺乏症患儿的疗效

目的探讨不同剂量生长激素治疗生长激素缺乏症(GHD)的疗效。方法GHD患儿35例分为2个治疗组。A组16例,rhGH每周的总剂量为0.5IU/kg,分5d皮下注射,每次注射剂量为0.1IU/kg;B组19例,rhGH总剂量为0.7IU/(kg.周),分7d皮下注射,每次注射剂量为0.1IU/kg。患儿均连续使用rhGH皮下注射最少6个月。观察指标为治疗前后身高增长速度、治疗前后实际年龄的身高均值标准差计分、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)、治疗前后骨成熟情况(骨龄/实际年龄的变化)。结果治疗期间二组患儿身高均明显增加,生长速度均明显增快,身高均值标准差记分均明显升高,同一组患儿治疗前后差异有统计学意义。二组患儿治疗前后各指标比较无统计学差异。结论GHD儿童应用rhGH每周0.5IU/kg,与每周0.7IU/kg比较疗效相同。每周0.5IU/kg,可节省药物剂量,延长患儿用药时间,也减轻了患儿注射的痛苦。

基于目的基因捕获的二代测序技术对质谱检测阳性患儿的分子诊断

目的运用基于目的基因捕获的二代测序技术,对质谱检测阳性的遗传代谢病疑似患儿进行基因检测,探讨二代测序技术在遗传代谢性疾病诊断的应用价值。方法回顾性收集复旦大学附属儿科医院遗传代谢专科门诊收治的、质谱检测阳性遗传代谢病疑似患儿的剩余干血滴滤纸片,行目的基因捕获的二代测序,行Sanger进行验证。结果 2013年6月至2014年5月共有48例质谱检测阳性的遗传代谢病疑似患儿纳入本文分析,40例完成二代测序,男性22例。40例测序标本中,29例(72.5%)检测到与临床症状相符的基因变异,包括甲基丙二酸血症6例,citrin缺陷病6例,高苯丙氨酸血症5例,戊二酸血症3例,其他遗传代谢病9例。2例疑似citrin缺陷病的标本在SLC25A13基因上仅检测到单个致病性突变,进一步行长片段PCR,检测到2例标本均存在3 kb的杂合插入突变。结论基于目的基因捕获的二代测序技术在对临床疑似遗传代谢病的检测中,有着较高的阳性诊断率,不仅能为临床医生提供可靠的分子诊断依据,而且可以根据致病基因对疾病分型,有效地为后续的临床治疗和遗传咨询提供依据。

赖氨酸尿性蛋白耐受不良1家系(1例合并系统性红斑狼疮)报告并文献复习

目的总结赖氨酸尿性蛋白耐受不良(LPI)1家系2例患者临床特征及基因突变的特点,提高对该病的认识。方法收集PLI 1家系2例患儿(同胞姐弟)的临床资料,包括病史、肾脏病理、相关实验室检查和家族史等。采用外显子捕获法对患儿及其父母行全外显子测序(WES)并行生物信息学分析,行Sanger验证并在家系其他成员中进行突变分析。结果先证者,女,10岁,断乳后反复呕吐和腹泻,抵触富含蛋白的食物,生长落后,身高低于同年龄、同性别儿童;5岁后鼻自发性出血,外周血"三系"(RBC、WBC、PLT)低于正常值,9.7岁后出现轻度蛋白尿和持续性镜下血尿;免疫系统受累,检出ANA和ds-DNA等多种自身抗体。血清铁蛋白、乳酸脱氢酶和血氨增高,尿乳清酸增高,血清和尿液赖氨酸、精氨酸和瓜氨酸改变不明显。肾活检病理提示狼疮性肾炎。家系调查发现,先证者之弟,男,6.5岁,断乳后反复呕吐,抵触富含蛋白食物,生长落后,身高低于同年龄、同性别儿童,血清铁蛋白、乳酸脱氢酶增高,尿乳清酸增高,血清、尿液赖氨酸、精氨酸和瓜氨酸改变不明显。先证者及其父母WES测序显示SLC7A7基因IVS4+1G>A纯合突变,突变来源其父母,先证者之弟也存在该突变。例1诊断为LPI合并SLE,例2诊断为LPI。结论 SLC7A7基因测序是确诊LPI的依据;LPI并发系统性红斑狼疮(SLE)非常罕见,SLC7A7是否为单基因型SLE致病基因需进一步研究。

门冬胰岛素在青少年1型糖尿病胰岛素泵中的应用

目的:评价新型速效胰岛素类似物门冬胰 岛素注射液在中国青少年1型糖尿病胰岛素泵治疗 中的有效性和安全性并与常规人胰岛素泵治疗比 较。方法:10例正在使用胰岛素泵的青少年1型糖 尿病病人,年龄(13±s3)a,进行4wk的纳入期(继 续常规人胰岛素治疗)和8wk的治疗期(改用门冬 胰岛素治疗),共12wk的研究,观察治疗前后餐后 2h血糖(PBG)、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白 (HbA1c)和不良反应。结果:治疗8wk后,FBG, PBG和HbA1c分别由(9±3)mmol·L-1,(11.6± 2.7)mmol·L-1和(9.1±2.0)%下降至(6± 3)mmol·L-1,(7±3)mmol·L-1和(7.6± 1.2)%。PBG和HbA1c与治疗前比较差异有非常 显著和显著意(P<0.01,P<0.05)。治疗过程中 低血糖事件无明显增加。结论:门冬胰岛素能有效 降低青少年1型糖尿病病人PBG和HbA1c,无明显 不良反应,是目前胰岛素泵治疗中满意的胰岛素类 型。

尿铜蓝蛋白在青少年1型糖尿病肾病早期检测中的价值

目的 以尿微量白蛋白排泄率为参照 ,对比检测尿铜蓝蛋白的排泄情况 ,以了解其在青少年 1型糖尿病肾病早期检测中的价值。方法 青少年 1型糖尿病患者 4 0例 ,肾病综合征对照 2 1例 ,正常青少年对照 6 0例 ,收集 2 4h尿液。放免法测定尿微量白蛋白 ,ELISA法测定尿铜蓝蛋白。结果 糖尿病和肾病综合征组尿微量白蛋白、铜蓝蛋白较正常对照显著增加 (P <0 .0 5 ) ,糖尿病患者尿铜蓝蛋白排泄异常者占 4 7.5 % ,尿微量白蛋白异常者占 10 % ,尿铜蓝蛋白随病程增高的幅度大于尿微量白蛋白增高的幅度。尿铜蓝蛋白与尿微量白蛋白、HbA1c显著正相关。结论 尿铜蓝蛋白可能是反映青少年 1型糖尿病患者早期肾损害的更为灵敏的指标。

儿童青少年糖尿病患儿胰岛功能及分型

目的研究儿童青少年糖尿病diabetesmellitusDM患儿胰岛功能及分型。方法对56例DM患儿做胰高血糖素激发试验,其中C肽正常者1年后复查;以12例非DM患儿为对照。结果①DM组C肽基础值BCP、胰高血糖素刺激后C肽PGCP、C肽增高值ICP均低于对照组(P<0.05)。②C肽降低组43例BCP、PGCP、ICP均低于对照组(P<0.05);C肽正常组13例BCP、PGCP与对照组差别无显著性,ICP低于对照组(P<0.05)。③C肽正常组10例复查激发试验,6例C肽降低,4例C肽正常。④经胰高血糖素激发试验,结合临床表现,诊断初发患儿C肽降低者为1型糖尿病,C肽正常者可能为2型糖尿病,但需随访胰岛功能,1年后C肽降低者仍为1型糖尿病。结论胰高血糖素激发试验能较好反映胰岛功能,有助儿童青少年糖尿病分型。

动态血糖监测系统在糖尿病诊断治疗中的应用

糖尿病是全球关注的健康问题。血糖监测是糖尿病诊治中的关键。虽然传统的自我血糖监测技术已很成熟,但仍存在不足。动态血糖监测正逐渐成为新的血糖监测方式,更好的提供自我血糖监测所不能提供的全天候血糖变化的趋势。本文将对动态血糖监测系统的组成、工作原理及应用进展进行简要的介绍。

X-连锁严重联合免疫缺陷病一家系分析并文献复习

目的总结分析严重联合免疫缺陷病(SCID)的临床表现、诊断方法和治疗。方法对1例生后2个月内起病,严重感染,使用抗生素治疗效果不佳,生后5个月病死,常规实验室检查外周血淋巴细胞绝对计数减少,WBC总数2.8×109·L-1,L1.9×109·L-1的患儿,使用流式细胞仪检测患儿及其双亲的外周血淋巴细胞表达,并抽提出DNA,对IL-2受体γ链(IL2RG)进行基因分析。外周血淋巴细胞转化试验检测患儿舅舅淋巴细胞增殖能力。回顾分析患儿家族史,通过问诊进行初步家系调查。结果流式细胞仪检测患儿外周血CD3+T细胞为0;NK细胞(CD16+CD56+)为4%。患儿X染色体q13.1的IL2RG基因的第6个外显子存在突变,突变位为849位碱基G缺失导致阅读框架移位,氨基酸序列位于278半胱氨酸处,并在293位产生"TGA"的终止密码子。患儿母亲被证实为携带者,但不是单纯的杂合子,可能存在嵌合突变。患儿被诊断为X-连锁严重联合免疫缺陷病(X-SCID)。患儿的舅舅生后因严重感染治疗无效而病死,其淋巴细胞转化试验植物血凝素(PHA)刺激72h,外周血单个核细胞无增殖反应(CPM值为0)。病程中使用未经特殊处理的血制品后出现高热、皮疹和肝、脾肿大后病死。回顾分析家族史,患儿母系中近3代出生男性4例均因严重感染而在婴幼儿期夭折,考虑可能也是X-SCID,女性均健康。患儿妹妹经基因分析证实亦为携带者,为IL2RG基因的第6个外显子849位碱基嵌合型。患儿的舅舅使用未经特殊处理的血制品出现的临床表现为移植物抗宿主病可能。结论经基因分析确诊了1例X-SCID,通过初步家系调查,基因分析证实患儿母亲及妹妹均为嵌合型携带者。临床上对出生后6个月内严重感染,治疗效果不佳者应警惕SCID的可能,并应进行免疫功能评价。如果疑为SCID患儿则不能接种活疫苗和使用未经特殊处理的血制品。早期进行造血干细胞移植可以重建患儿的免疫系统,提高长期生存率。应提高儿科医务人员对该病的认识。

resistin与胰岛素抵抗的研究进展

肥胖可引起胰岛素抵抗和2型糖尿病,但其确切机制尚不清楚。新近发现小鼠白色脂肪组织可特异分泌一种富含半胱氨酸的蛋白质,被认为是小鼠肥胖与胰岛素抵抗的重要中间环节,称为胰岛素抵抗因子（resistin）。小鼠resistin的基因定位于第8对染色体上,resistin仅在小鼠的白色脂肪组织中有高度表达,属于富含半胱氨酸的分泌型蛋白RELMs（resistin-like molecules）家族,其水平在由3T3-L1细胞向成熟脂肪细胞转化的过程中显著增高,并与胰岛素抵抗有紧密的联系。地塞米松能促进resistin基因表达,而异丙肾上腺素与肿瘤坏死因子α则能抑制其表达。在人类脂肪细胞表达的resistin同源物,基因定位在第19对染色体,其组织分布与作用尚有待进一步研究。本文介绍了胰岛素抵抗因resistin的发现过程、其家族特点、与胰岛素抵抗及其调节因子的关系等。

1型糖尿病儿童血、尿一氧化氮水平观察

目的:探讨儿童1型糖尿病(TlDM)患者血尿一氧化氮水平及意义。方法:采用镉柱层析还原法,测定107例TlDM患儿(年龄10.5±2.4岁)尿硝酸盐(NO_3^-)含量(男性49例,女性58例),同时测定44例患儿血NO_3^-(男性24例,女性20例)及30例健康儿童(10.1±1.8岁)血、尿NO_3^-。结果:TlDM组与对照组血NO_3^-无显著差异(TlDM组55±49μmol/L,对照组76±26μmol/L,P>0.05),但尿NO_3^-量有显著差异。且TlDM组各病程段均高于对照组(527±234μmol/L,P<0.001)。结论:儿童TlDM患者尿NO_3^-排泄量显著增加,并随着尿糖的转阴及病程的延长而减低,增高的尿NO_3^-可能与高血糖所致的DM早期肾脏高灌注、高滤过有重要相关性,并可能参与糖尿病肾病的发生。

ANKRD11基因突变所致KBG综合征1例并文献复习

目的报告1例KBG综合征患儿的临床表型和基因型特点,提高对本病的认识。方法采集1例KBG综合征患儿的临床资料,采集家系外周血行全外显子基因测序(WES),Sanger测序验证。检索中英文数据库中已报道的ANKRD11突变导致KBG综合征的病例,总结临床特征及基因突变谱。结果女,8岁,因"生长发育迟缓"就诊。生后匀称性矮小并有特殊面容,手短伴第5手指弯曲,语言发育迟缓;生长激素激发峰值5.7 ng·m L-1;WES检测发现ANKRD11基因c.6792dupC(p.P2271Pfs*8)杂合突变,导致ANKRD11蛋白自第2 271位起后第8位编码天冬氨酸的密码子突变为终止密码子,使高度保守的羧基末端肽链合成提前终止,为有害突变。文献复习共检索到22篇(加上本文病例共155例KBG综合征患者),男∶女比1.5∶1,包括ANKRD11基因突变114例和16q24.3微缺失型41例,临床表现以颅面部异常如三角形脸(31.8%～64.2%)、眼距过宽(24.0%～61.7%)、鼻梁宽(31.3%～82.7%)、人中异常(52.4%～86.8%)、中枢神经系统异常如语言发育迟缓(92.6%～93.6%)、智力低下(66.7%～73.0%)、学习障碍(71.4%～75.0%),上颌中切牙过大(55.6%～84. 4%)、骨骼异常如小指侧弯(53.5%～72.6%)和矮小(57.5%～72.6%)最为经典。ANKRD11突变型及16q24.3微缺失型分别检出先天性心脏病12.2%,28.9%;16q24.3微缺失型检出特发性血小板减少性紫癜(ITP)12.2%。结论语言发育迟缓、学习障碍、智力低下等中枢神经系统异常表现是KBG综合征特异性表型,如合并典型的颅面部异常(三角形脸、眼距过宽、鼻梁宽、人中异常)、上颌中切牙过大、矮小及小指侧弯,需考虑ANKRD11基因突变型;16q24.3微缺失型除表现中枢神经系统特异性表型外,常合并隐睾、先天性心脏病及ITP等异常。