CXCR4基因沉默对黑色素瘤侵袭和转移影响的实验研究

目的探讨CXCR4基因沉默对黑色素瘤侵袭及转移的影响及可能机制。方法设计合成CXCR4特异性短发夹状RNA(shRNA)插入p Silencer载体,转染人高转移性黑色素瘤细胞株MV3、RT-PCR和Western blot法检测shRNA对靶基因CXCR4表达的影响。利用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力,MTT法检测细胞体外增殖能力。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射,将转染后的细胞接种至裸鼠皮下,构建黑色素瘤转移模型,观察肿瘤生长情况。结果 CXCR4-shRNA能有效下调CXCR4基因的表达,降低黑色素瘤细胞增殖、体外侵袭及转移能力。RT-PCR及细胞免疫荧光显示,转染CXCR4-shRNA的黑色素瘤瘤MV3细胞系MMP-2表达下调;免疫组化结果显示,实验组裸鼠黑色素瘤瘤体及转移灶组织MMP-2的表达低于对照组。结论 shRNA介导的CXCR4基因沉默在体外实验能够显著抑制黑色素瘤细胞的生长和增殖活性,减弱体外侵袭能力,且体外产生抑瘤效应,明显降低肝、脑器官转移能力和定向肺转移能力。其机制可能与SDF-1/CXCR4信号途径阻断,进而抑制MMP-2的表达有关。

淫羊藿苷拮抗脂多糖炎症模型的体内和体外研究

目的从前炎症细胞因子、炎性介质、黏附分子等环节,评价淫羊藿苷的抗炎作用。方法以脂多糖(LPS)刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7建立体外炎症模型,以LPS刺激C57BL/6J小鼠建立体内炎症模型,采用淫羊藿苷干预,并以地塞米松为阳性对照。采用CCK-8试剂盒检测细胞活力;采用酶联免疫法检测细胞培养上清和血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)含量;采用Griess Reagent法检测细胞培养上清一氧化氮(NO)含量;采用流式细胞术检测小鼠中性粒细胞表面黏附分子CD11b表达;采用病理切片HE染色观察肺部炎症细胞浸润。结果体外研究表明:淫羊藿苷(1、10、100μg/mL)均未显示出细胞毒性作用(P<0.01);淫羊藿苷(10、100μg/mL)可显著抑制RAW264.7TNF-α、IL-6产生(P<0.01);淫羊藿苷100μg/mL可显著抑制NO释放(P<0.01)。体内研究表明:淫羊藿苷(20mg/kg)可显著降低小鼠血清TNF-α、IL-6的水平(P<0.01),减少小鼠中性粒细胞表面黏附分子CD11b的表达(P<0.01),减轻小鼠肺部炎症细胞浸润。结论淫羊藿苷是一种安全有效的天然抗炎药物,对前炎症细胞因子(如TNF-α、IL-6)、炎症介质(如NO)和黏附分子(如CD11b)等的多环节干预是其部分疗效机理。

阿托伐他汀改善高LDL-C相关血小板活化异常的临床研究

目的探讨口服阿托伐他汀对高LDL-C血症相关的血小板异常活化功能的改善作用,阐明他汀类药物降低临床事件的新机制。方法从2012年11月至2013年7月于华山医院门诊就诊人群中,纳入LDL-C≥4.14mmol/L同时三酰甘油(triglycerides,TG)<1.7mmol/L且未经调脂治疗和抗血小板治疗者作为研究对象,作为阿托伐他汀治疗组(AT组),从体检中心招募健康志愿者作为对照组。测定血小板最大聚集率(maximal platelet aggregation,MPAG),全血流式细胞检测法测定血小板活化标志物CD62p(P-选择素)和PAC-1(GpⅡbⅢa)水平。对患者予以标准他汀治疗(阿托伐他汀20mg/天),并于治疗后1个月、2个月随访检测以上指标。结果 AT组共纳入40例,其中33例完成研究;对照组纳入并完成35例。两组人群基线资料(年龄、性别、BMI、吸烟史、血压、冠心病家族史、血糖)无明显差异;AT组患者服用阿托伐他汀治疗后,TC、TG、LDL-C均明显下降(P<0.05);基线时AT组血小板最大聚集率与对照组相似(33.03%±15.87%vs.29.05%±17.75%,P=0.102),采用他汀治疗2个月后,AT组患者血小板最大聚集率较基线显著下降但差异无统计学意义(P=0.073)。治疗前AT组CD62p和PAC-1均高于对照组(1.72±0.96 vs.0.90±0.77,P<0.001;4.33±2.42 vs.2.63±2.03,P<0.01);阿托伐他汀治疗2个月后,CD62p和PAC-1分别为0.85±0.72和1.50±1.07,与治疗前比较,两者表达均明显下降(P<0.05)。结论临床上阿托伐他汀可以改善高LDL-C相关的血小板活化。

ESWAN序列在星形细胞肿瘤分级及鉴别诊断中的应用

目的:探讨ESWAN序列在星形细胞肿瘤分级及鉴别诊断中的作用;方法:回顾性分析复旦大学附属华山医院东院手术的脑星形细胞肿瘤患者35例及其他类型病变39例。行常规MRI、增强T1 FLAIR及GEESWAN序列扫描,根据各种肿瘤内ITSS数目将其分级。结果:低级别星形细胞肿瘤、间变型星形细胞瘤、胶质母细胞瘤的ITSS分级具有显著差异;并且随着肿瘤级别增高,ITSS分级增高,提示星形细胞肿瘤随着级别的增高,其血管增殖及微出血相应增多。高ITSS分级(3级)可用于鉴别诊断GBM/HAT与淋巴瘤,但是不能鉴别GBM/HAT与颅内孤立性转移瘤。结论:通过ESWAN序列扫描,经ITSS分级检测,对星形细胞肿瘤的分级具有重要意义,并且有助于鉴别GBM/HAT和颅内孤立性淋巴瘤。

PMEPA1在前列腺癌中的表达及临床意义

目的探讨一种编码受雄激素诱导的前列腺跨膜蛋白基因——PMEPA1(transmembrane prostateandrogen induced RNA)的表达,预测前列腺癌非激素依赖型变化的临床意义。方法采用实时荧光定量PCR检测PMEPA1及GSTP1 mRNA在前列腺癌细胞系LNCaP、PC-3、良性前列腺增生上皮细胞及33例前列腺癌和16例前列腺增生组织中的表达情况。结果GSTP1及PMEPA1在前列腺癌细胞系中的表达均下调。GSTP1在6.1%的前列腺癌患者中表达上调,在81.8%的患者的前列腺癌组织中表达下调,在12.1%的患者中表达无明显差异;PMEPA1在27.3%的前列腺癌患者的前列腺癌组织中表达上调,在27.3%的患者中表达下调,在45.4%的患者中表达无明显差异。统计分析表明,GSTP1的表达与年龄有关,与PSA、TNM分期、有无骨转移及分化程度无显著关系;PMEPA1的表达与肿瘤的分化程度及是否有骨转移有关,而与年龄、PSA、TNM分期无显著关系。结论PMEPA1有可能作为区分临床预后较差的前列腺癌的分子学标记,但需要进一步做大样本的研究。

ESWAN序列相位值在星形细胞肿瘤分级中的应用

目的:探讨ESWAN序列相位值在星形细胞肿瘤分级中的作用。方法:回顾性分析经病理证实的35例脑星形细胞肿瘤患者的MR资料。在ESWAN序列相位图上直接选择肿瘤实质区域内ROI,测量肿瘤实质、其对侧正常脑组织同等面积ROI区域、瘤周2cm以内脑组织、其对侧脑组织同等面积ROI的相位值,分析各组间是否存在显著性差异。结果:低级别星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、胶质母细胞瘤与其对侧正常脑组织相位值存在显著差异;并且,上述不同级别星形细胞肿瘤组间存在显著差异,提示肿瘤实质相位值与星形细胞肿瘤的级别具有密切关系;这种相位值的改变可能是由于星形细胞肿瘤内铁蛋白的沉积引起。结论:通过ESWAN序列扫描,经肿瘤实质相位值检测,对星形细胞肿瘤的分级具有重要意义。

大数据时代必知

近年来，随着计算机及信息技术的飞速发展和行业普及应用，行业应用系统规模迅速增大，行业应用产生的数据呈爆炸式增长。西方发达国家已经从科技战略层面上提出一系列的大数据研究计划来推动大数据技术的探索、研究及应用。大数据带来巨大挑战的同时也带来了巨大的商业机遇，不断产生的海量大数据包含很多小数据不具备的潜在深度价值，数据分析挖掘能够对行业、企业带来巨大的商业价值，对实现各种高附加值的服务打下坚实的理论基础及创新应用方法，能够进一步提升行业、企业的经济效益及社会效益。

视网膜母细胞瘤中DLC-1启动子甲基化异常

目的探讨肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer-1,DLC-1)启动子在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)中的甲基化情况及与临床参数的关系。方法收集37例RB石蜡切片,4例正常眼部组织标本和2株RB细胞系(WERI-Rb1及Y79)。用甲基化敏感性高分辨率熔解(MS-HRM)法定量检测DLC-1甲基化情况,用亚硫酸氢盐测序对其进行验证,并用RT-PCR检测WERI-Rb1和Y79细胞系中DLC-1 mRNA的表达。结果 35.1%的RB中存在DLC-1启动子甲基化,而在正常眼部组织中未发现甲基化;WERI-Rb1和Y79检测出DLC-1 mRNA表达。DLC-1启动子甲基化与肿瘤分化、伴随其他肿瘤和家族史均无显著关系,但单侧RB患者中的DLC-1甲基化率明显高于双侧患者(P<0.05)。结论 RB患者DLC-1启动子存在一定程度的甲基化,DLC-1甲基化在RB的发生、发展中具有一定的作用。

DMBT1基因在前列腺癌中表达的显著下调及临床意义

目的研究前列腺癌发生过程中可能受甲基化调节的基因,检测其在前列腺癌细胞系和组织中的表达并分析其表达水平与临床病理特征的关系。方法采用人类全基因表达谱芯片筛选出可能因去甲基化导致恢复表达的基因后,以实时荧光定量PCR检测其在前列腺癌细胞系LNCaP、PC-3及39例前列腺癌和16例前列腺正常组织中mRNA的表达情况。Western blot检测以上标本中目的蛋白的表达水平。结果在用甲基化抑制剂处理后,PC-3细胞系中DMBT1(deleted in malignant braintumor)基因表达显著上调,而在LNCaP细胞系中未见到显著改变。在100%的前列腺癌患者组织中DMBT1 mRNA及蛋白表达均显著下调。统计分析表明,DMBT1 mRNA的表达水平与cTNM分期及骨转移有关,而与年龄、PSA水平及肿瘤分化程度无显著关系。结论 DMBT1有可能成为指导前列腺癌分期及判断预后的分子标志物。但DMBT1的调控机制以及DMBT1在细胞生理和肿瘤发生中的作用还需要进一步的研究。

PEDF肽段44-mer对前列腺癌细胞PC-3分化作用的研究

目的观察色素上皮细胞衍生因子(PEDF)肽段44-mer(57-101)诱导激素非依赖性前列腺癌(PCa)细胞PC-3发生神经内分泌分化(NED),并探讨其对前列腺癌的治疗机理。方法体外合成44-mer并对PC-3的生长进行干预,以采用不同浓度44-mer诱导作为实验组,未用44-mer诱导作为对照组。从形态、标志物两方面证实部分细胞发生NED;采用水溶性四氮唑(WST-1)、流式细胞仪检测诱导后细胞的增殖情况及细胞周期。建立荷瘤裸鼠模型,实验组腹腔注射44-mer,定期测量肿瘤体积,并对标本进行免疫组化染色以检测嗜铬粒素A(ChrA)的表达情况;对照组腹腔注射磷酸盐缓冲液(PBS),并定期测量肿瘤体积。结果实验组PC-3中发生NED形态学改变的细胞所占的比率为18.65%±1.26%,明显高于对照组(3.62%±0.44%)(P<0.01);1、10、100 nmol/L44-mer分别诱导PC-3 3 d后培养液中的ChrA水平分别为(168.97±5.36)、(263.95±5.30)、(325.24±5.74)ng/mL,均高于对照组[(115.97±2.16)ng/mL](P均<0.01);免疫印迹法显示实验组PC-3神经特异性烯醇化酶(NSE)、ChrA的表达升高;实验组G0/G1期的细胞占79.24%±3.24%,明显高于对照组(65.18%±4.53%)(P<0.05);1、10、100 nmol/L44-mer诱导PC-3 6 d后WST-1实验的吸光度值分别为2.05±0.07、1.98±0.06、1.78±0.09,均低于对照组(2.54±0.08,P均<0.01)。与对照组肿瘤体积[(574.70±63.78)mm3]相比,实验组的肿瘤体积明显减小[(222.21±49.51)mm3](P<0.01),且标本中ChrA表达上升。结论 44-mer诱导PC-3发生NED,并抑制其在体内外的增殖。

炎症性肌病25-羟基维生素D水平及相关指标的临床意义

目的探讨特发性炎症性肌病(IIM)血清25-羟基维生素D[25(OH)D]水平及其临床意义。方法选取未经治疗的IIM患者35例,以44例其他自身免疫性疾病患者作为疾病对照组。检测所有患者的25(OH)D、白细胞(WBC)、中性粒细胞绝对数(NEUT#)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌红蛋白(MYO)、心肌肌钙蛋白T(cT nT)、补体(C)3、C4、IgA、IgG、IgM、抗Jo-1抗体、抗核抗体,并对结果进行统计分析。结果 IIM组25(OH)D、Cr、UA、BUN水平均明显低于疾病对照组(P<0.05),ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、MYO、C4水平及抗Jo-1抗体阳性率均明显高于疾病对照组(P<0.05),而性别、年龄、Hb、WBC、NEUT#、PLT、cT nT、IgA、IgG、IgM、C3及抗核抗体分型2个组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 IIM患者血清25(OH)D水平明显低于其他自身免疫性疾病,可作为IIM与其他自身免疫性疾病鉴别诊断的辅助指标。

细胞外腺苷介导核苷转运体ENT1阻断cAMP/p-PKA信号通路抑制肝脏糖异生

糖尿病的关键特征是葡萄糖和脂质代谢紊乱。目前,糖尿病已成为沉重的全球疾病负担。越来越多的证据表明,腺苷系统在调节胰岛素和葡萄糖平衡中发挥关键作用。腺苷是一种重要的细胞代谢调节剂,通过激活G蛋白偶联受体和核苷转运体参与能量代谢、免疫调节、氧化应激等多个生理病理过程。然而,腺苷在肝脏糖异生调控中的角色尚未被阐明。该文从多层面验证了腺苷通过核苷转运体(equilibrative nucleoside transporter,ENT)转运入胞内后对胰高血糖素刺激引起的肝脏糖异生通路的影响。结果显示,在体内模型中,外源性腺苷显著抑制小鼠血糖升高。在细胞模型中,腺苷以剂量依赖的方式抑制肝脏糖异生进而降低葡萄糖输出水平,且无细胞毒性。肝脏组织及细胞中ENT广泛表达,其中1型核苷转运体(equilibrative nucleoside transporter 1,ENT1)介导了腺苷抑制的肝糖输出。此外,腺苷介导的糖异生抑制并非依赖于AMP依赖的蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]通路的激活。最后发现,细胞外腺苷刺激后,细胞内的环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)浓度显著降低,磷酸化蛋白激酶A(phospho-protein kinase A,p-PKA)下游蛋白表达受抑制,细胞糖输出能力显著下降,该抑制作用可被ENT抑制剂有效逆转,但不能被AK抑制剂削弱。以上结果表明,细胞外腺苷通过ENT1转移入胞内后,抑制AC活性,从而抑制cAMP合成和p-PKA底物蛋白的表达,抑制肝脏糖异生功能,最终降低糖输出水平。

采用荧光定量PCR检测JAK2基因V617F突变

目的建立荧光定量PCR检测JAK2基因V617F突变的方法，评估JAK2 V617F突变在诊断骨髓增殖性疾病和白血病中的临床意义。方法选取71例慢性粒细胞性白血病（CML）、22例原发性血小板增多症（ET）、11例原发性骨髓纤维化（PMF）、9例真性红细胞增多症（PV）、7例嗜酸粒细胞增多症患者，分别采用荧光定量PCR、突变特异性扩增系统（ARMS）对JAK2 V617F突变进行检测，并采用基因测序对结果进行验证。将具有JAK2 V617F纯合子突变的人类红白血病细胞株（HEL）DNA作为阳性对照，比较荧光定量PCR和ARMS对JAK2基因V617F突变的检测敏感度。结果采用荧光定量PCR检测，野生型的熔解温度（Tm）峰出现于（75．0±0．2）℃处，突变型的Tm峰出现于（76．6±0．2）℃处。JAK2基因V617F突变在PV、ET、PMF等骨髓增殖性疾病中的检出率分别为8例（88．9％）、12例（54．5％）、7例（63．6％），但在71例CML中只检出1例（1．4％）。荧光定量PCR与ARMS的结果符合率为100％，结果经过测序证实。使用荧光定量PCR法可在每10^6个正常白细胞中检出低至10^2个HEL细胞，而使用ARMS方法时要在每10^6个正常白细胞中HEL细胞达到10^4个时，方可检测出，前者比后者方法灵敏100倍。结论成功地建立了荧光定量PCR检测JAK2基因V617F突变的方法，比ARMS更灵敏、简便，适合临床使用。JAK2基因V617F突变在骨髓增殖性疾病中有较高的检出率，可作为骨髓增殖性疾病特异性诊断指标。

高分辨熔解方法的建立及在真菌感染患者CYP2C19遗传多态性检测中的应用

目的探讨高分辨熔解方法（high resolution melting，HRM）检测真菌感染患者CYP2C19遗传多态性的可行性。方法建立HRM方法检测CYP2C19S2和CYP2C19S3两个多态性位点的基因型，并与传统方法PCR-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）及序列分析结果相比较，进一步应用于47例真菌感染患者基因型的检测与分析。结果2种方法检测CYP2C19S2和CYP2C19＊3基因型结果完全一致，与DNA序列分析结果也相吻合，而HRM方法操作更为简便，耗时更短。47份临床标本检测结果显示，CYP2C19的2个多态性位点存在不同基因型，CYP2C19＊1／＊1所占比例为48．9％（23／47），CYP2C19＊1／＊2为25．5％（12／47），CYP2C19＊1／＊3为6．4％（3／47），CYP2C19＊2／＊2为12．8％（6／47），CYP2C19＊2／＊3为6．4％（3／47）。结论HRM方法能有效检测CYP2C19基因多态性，且较PCR—RFLP方法更为简便、快速。此外，CYP2C19基因在真菌感染患者中存在明显的遗传多态性。

中国男性痛风患者SLC2A9基因单核苷酸多态性与尿酸水平的关系

目的SLC2A9是新近发现的尿酸转运子，该基因单核苷酸多态性可影响血清尿酸水平。本研究检测SLC2A9基因第6内含子rs7442295多态性在中国男性痛风和原发性高尿酸血症患者中的分布情况以及与尿酸代谢指标的相关性。方法选取268例原发性痛风患者和288名健康志愿者，分别检测血压、体质量指数、血尿酸、血糖、血脂、肾功能水平，并同时提取外周血DNA，运用高分辨率熔解曲线（HRM）分析rs7442295基因型，并用测序法证实。统计学方法采用矿检验及t检验。结果运用HRM技术能准确区分rs7442295～A和A／G基因型，而G／G基因型则在本研究人群中未发现。A／A和A／G基因型在人群分布频率分别是96．2％和3．8％。与健康对照组相比，痛风组的A／A和A／G基因型频率及A、G等位基因频率分布差异无统计学意义（矿=0．003，P=0．82；x2=0．003，P=1．00），但携带A／G基因型个体的尿酸水平[（293±100）μmol／L]明显低于携带A／A基因型的个体[（392±133）μmol／L]（t=2．426，P〈0．01），且正常尿酸组内A／G基因型频率明显高于高尿酸组0（2=6．279，P=0．01），基于HRM技术的基因分型结果与测序法所得结果完全一致。结论SLC2A9基因~7442295多态性可能是评估中国汉族男性人群原发性高尿酸血症危险性的一个遗传学标志，HRM技术简单、方便、快速，并实现闭管检测，非常适合单核苷酸多态性分析。

前列腺癌组织中DLC-1启动子甲基化定量检测的HRM方法建立及其应用意义

目的建立HRM技术定量检测DLC-1启动子甲基化的方法，并分析探讨DLC-1甲基化程度与前列腺癌病理参数的相关性。方法选取89份前列腺癌组织以及10份匹配癌旁组织标本，采用LCM收集肿瘤细胞群，抽提DNA后进行甲基化修饰。以CpGenomeUniversal Methylated DNA作为100％甲基化样本，以100％非甲基化的健康人外周血DNA作为稀释剂，分别制成100％、80％、50％、30％、10％、0％系列浓度的标准曲线，并进行重复性和灵敏性评价。同时用HRM技术定量检测前列腺癌细胞中DLC-1甲基化水平，探讨DLC-1甲基化程度与前列腺癌患者年龄、PSA水平与前列腺癌TNM的关系。结果100％、80％、50％、30％、10％、0％甲基化标准品的HRM熔解曲线从右往左依次排列，10份癌旁组织标本、35份前列腺癌组织标本重叠在0％标准曲线上；5份前列腺癌组织标本位于0％～30％区域内，29份位于31％～80％区域内，20份位于81％-100％区域内。HRM技术最低检测限可达10％的甲基化水平，优于MSP检测（30％甲基化水平）。DLC-1甲基化水平与前列腺癌患者年龄无明显相关（χ2=3．29，P=0．19），与PSA水平也无相关性（χ2=2．04，P=0．36），但DLC-1甲基化水平与TNM分期显著相关（r=9．04，P=0．01），且随TNM分期增高而增高。结论成功建立的HRM技术定量检测DLC-1甲基化水平的方法稳定、灵敏、操作简单，DLC-1启动子甲基化有望成为评估前列腺癌TNM的分子指标。

荧光PCR结合熔解曲线法检测JAK2 V617F突变方法的建立及其方法学验证

目的 参考美国病理学家协会（CAP）相关要求,验证本实验室自建的JAK2 V617F突变检测项目的各项性能参数.方法 方法学建立.收集2010年4月至12月复旦大学附属华山医院已确诊的57例BCR/ABL融合基因阴性骨髓增殖性肿瘤患者的外周血和骨髓液标本.采用荧光PCR结合熔解曲线法建立JAK2 V617F突变方法检测标本.在准确度、重复性、分析灵敏度、干扰物质的影响等各方面对检测方法的性能进行评估.准确性使用Kappa检验评估,重复性使用符合率,分析灵敏度使用配对t检验进行统计分析.结果 荧光PCR结合熔解曲线方法（试验方法）与参考方法（测序法）相比有非常好的一致性（Kappa=0.89）；重复性符合率为100％；血脂（＜24 mmol/L）和黄疸（＜450 μmol/L）对本试验无明显干扰；最低检测突变率为5％.结论 基于荧光PCR结合熔解温度反应方法检测JAK2 V617F突变可应用于临床检测.

人类白细胞抗原B＊5801与别嘌醇诱发重症药疹相关性研究

目的 调查中国大陆人群中HLA-B＊ 5801等位基因与别嘌醇和非别嘌醇药物诱发重症药疹的相关性,评估HLA-B＊5801作为别嘌醇诱发重症药疹危险性预测指标的临床价值.方法 分别收集43例和133例服用别嘌醇后发生或未发生重症药疹的患者,96例服用除别嘌醇外其他药物诱发重症药疹的患者,以及148名健康对照,采用PCR-序列特异引物（SSP）检测HLA-B ＊ 5801等位基因携带情况,并以x2检验作统计学分析.结果 43例服用别嘌醇后出现重症药疹患者样本中有40例携带HLA-B＊ 5801等位基因（93.o％）,148名健康对照中则只有19名（12.8％）,差异有统计学意义（x2=100.353,P＜0.01）;133例别嘌醇耐受病例中有10例携带HLA-B ＊ 5801（7.5％）,与对照组相比差异无统计学意义（x2=2.141,P＞0.05）;96例由其他药物诱发重症药疹的样本中有14例携带HLA-B＊ 5801（14.6％）,与对照组相比差异无统计学意义（x2=0.152,P＞0.05）.结论 HLA-B＊ 5801可作为别嘌醇服用患者特异性的服药前预测指标,可以指导高尿酸患者对降尿酸药物的选择.

原发性血小板增多症及原发性骨髓纤维化患者MPL515突变的筛查

目的建立一种能够简便、灵敏地检测原发性血小板增多症（ET）及原发性骨髓纤维化（PMF）患者外周血MPLS15突变的方法，探讨我国ET和PMF患者的MPLS15突变频率及JAK2V617F突变情况。方法选取2008至2010年复旦大学附属华山医院ET患者261例和PMF患者25例，提取患者外周血DNA。使用SYBRGreenI荧光定量PCR检测标本的JAK2V617F突变。分别采用针对MPLS15wt、MPLW515L和MPLW515K这3种基因型设计的Taqman探针，使用荧光定量PCR法检测MPLS15突变，并通过T—A克隆挑取纯克隆测序确认。结果在261例ET患者中，检测到JAK2V617F突变119例（45．6％），MPLS15突变7例（2．7％），包括5例MPLW515L突变、1例MPLW515K突变和1例MPLW515L＋K突变。25例PMF患者中，JAK2V617F突变为10例（40．0％），MPL515突变为3例（12．0％），包括1例MPLW515L突变和2例MPLW515L＋K突变。1例MPLW515K突变的ET患者同时伴有JAK2V617F突变。结论JAK2V617F是ET和PMF的分子标志物，而在JAK2V617F阴性的病例中，MPLS15突变则是一个重要、有益的补充。

采用微阵列数字PCR检测JAK2基因V617F突变

目的采用数字PCR检测骨髓增殖性肿瘤相关的JAK2基因V617F突变，评估该法的灵敏度、重复性和准确性。方法方法学评价。白2014—2015年间复旦大学附属华山医院收治的患者中，选取已知JAK2基因V617F突变的18例真性红细胞增多症病例、11例原发性血小板增多症病例、2例特发性骨髓纤维化病例及未知突变的6例红细胞异常增高病例和10名健康对照者。分别以HEL细胞株DNA和SW480细胞株DNA为突变型对照和野生型对照，稀释突变标准品为30％、10％、1％、0．1％和0．01％以验证微阵列数字PCR体系的灵敏度。使用两例低突变负荷样本（1％和10％），各重复5次，验证数字PCR体系重复性。以MGB探针法荧光定量PCR作为对照参考方法，检测微阵列数字PCR的检测性能。结果实验结果表明两种检测方法相关性高（R^2=0．9983），而微阵列数字PCR能够检测最低约0．1％的微量突变，相应的突变拷贝数绝对定量为0．16拷贝／μl。突变负荷为1％和10％的样本重复性检测结果CV分别为17．29％和7．50％。此外，MGB探针法和数字PCR法均成功地从31例已知突变的病例样本中均检出JAK2基因V617F突变阳性，而10名健康对照者都为阴性，两种方法得到的结果是一致的。从6例红细胞异常增高的病例中。MGB法未检出突变，而数字PCR成功检出2例微量突变样本，其突变率分别为0．37％和0．18％。结论微阵列数字PCR在JAK2基因V617F突变检测体系中表现出比荧光定量PCR的更高的灵敏度以及良好的稳定性，有助于其在体细胞突变微量情况下更准确地检出突变，避免漏诊误诊。