内皮细胞外泌体对神经干细胞活力的影响研究

目的探讨鼠微血管内皮细胞(bEnd.3)外泌体对神经干细胞活力的影响。方法大量培养鼠微血管内皮细胞(bEnd.3),收集细胞上清后提取外泌体并予以鉴定。对神经干细胞的作用分为外泌体组和对照组,其中外泌体组为含有60μg/mL外泌体的培养基培养,对照组为无外泌体培养基培养。采用Transwell共培养72h后检测bEnd.3对神经干细胞的细胞活力影响,采用CCK8法检测对照组和外泌体组细胞培养72 h后的细胞活力,采用平板细胞克隆实验检测2组细胞的增殖能力。结果与对照组比较,Transwell共培养72h后细胞的活力有所提高(1.16±0.52)%vs(3.99±0.12)%。与对照组比较,CCK8法检测外泌体组细胞培养72h时细胞活力明显提高(0.13±0.02)vs(0.18±0.02),细胞平板克隆实验检测结果为(5.6±1.52)vs(13.2±1.92),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论鼠微血管内皮细胞(bEnd.3)外泌体可影响神经干细胞的细胞活力。

骨髓间充质干细胞外泌体对氯化钴引起的神经干细胞凋亡的影响

目的探讨鼠骨髓间充质干细胞外泌体对神经干细胞凋亡及Wnt信号通路的影响。方法提取大鼠原代骨髓间充质干细胞,收集细胞上清后超速离心分离得到外泌体并予以鉴定。通过加入氯化钴(CoCl2)诱导神经干细胞发生化学性缺氧,从而导致细胞凋亡,CCK8检测氯化钴引起神经干细胞凋亡的最适浓度。对神经干细胞分为空白对照组、氯化钴组、外泌体组,培养12h通过Tunel检测细胞凋亡,并收集细胞Westernblot检测凋亡标志蛋白、凋亡相关蛋白及Wnt信号通路蛋白表达。结果通过Tunel可以看出外泌体能够降低神经干细胞的凋亡,并且能够通过抑制DNA修复酶(PARP)的切割,减轻神经干细胞的凋亡;并且能上调B淋巴细胞瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)和下调Bcl-2相关x蛋白(Bax)的表达;同时能够减轻氯化钴导致的Wnt信号通路的激活。结论骨髓间充质干细胞外泌体能够通过抑制Wnt信号通路抑制氯化钴对神经干细胞发生的凋亡诱导作用。

CXCL12联合VEGF对内皮祖细胞的增殖迁移及血管新生的影响

目的探索CXCL12与VEGF在EPC增殖、迁移和血管生成等过程中是否存在协同作用。方法 (1)用密度梯度离心法分离脐带血获取EPC并鉴定。(2)体外增殖实验:不同组别的细胞因子处理之后(CXCL12:10 ng/mL,50ng/mL,100 ng/mL;VEGF:10 ng/mL,50 ng/mL,100 ng/mL;CXCL12联合VEGF3组浓度分别为:10 ng/mL CXCL12+10 ng/mL VEGF;50 ng/mL CXCL12+50 ng/mL VEGF; 100 ng/mL CXCL12+100 ng/mL VEGF)CCK8检测细胞OD值。(3)体外细胞迁移实验:Transwell系统中不同浓度CXCL12及VEGF处理EPC后固定,DAPI染色,统计比较各组迁移到下层的EPC数。(4)体外管腔形成实验:不同组细胞因子处理EPC后(10 ng/mL VEGF,10 ng/mL CXCL12+10ng/mL VEGF; 50 ng/mL CXCL12+10 ng/mL VEGF; 100 ng/mL CXCL12+10 ng/mL VEGF)在基质胶上孵育4 h后,观察EPC管腔样结构的形成情况。结果与CXCL12相比,VEGF浓度依赖性的促EPC增殖;CXCL12联合VEGF促增殖能力在50 ng/mL浓度时达到高峰,但没有超过单独使用VEGF组。在迁移与管腔实验中,CXCL12联合VEGF组更能促进EPC的迁移和管腔形成能力,且呈浓度依赖性。结论 CXCL12和VEGF在一定浓度范围内联合的效应大于单一的作用,且有最佳浓度比例,可能会为EPC的移植治疗提供更好的生存环境。

星形胶质细胞分泌的外泌体对神经干细胞活力的影响研究

目的探讨小鼠星形胶质细胞外泌体对神经干细胞活力的影响。方法分离培养小鼠星形胶质细胞,收集细胞上清后超离出外泌体并予以鉴定。取原代培养的第2~6代神经干细胞,分别以0、20、40、60μg/mL外泌体的条件培养基处理,CCK-8法筛选出培养神经干细胞的最佳外泌体质量浓度(40μg/mL)。实验分为实验组(40μg/mL外泌体处理的神经干细胞)和对照组(加入同等体积PBS处理的神经干细胞),干预72 h后,EdU试剂盒标记阳性干细胞数。利用Transwell模型,通过4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色,荧光显微镜下分别统计出Transwell下室的实验组和对照组的细胞核个数。结果①星形胶质细胞外泌体的鉴定:通过电镜、蛋白免疫印迹实验、外泌体浓度粒径等技术鉴定细胞上清超离出的外泌体;②CCK8实验检测:随着外泌体质量浓度的增加,促进原代神经干细胞的增殖作用逐渐增强,且与对照组相比,40μg/mL、60μg/mL外泌体组对神经干细胞均有显著增殖作用,但此两组间比较无明显差异,所以选择40μg/mL为最佳干预质量浓度;③EdU检测:实验组EdU标记阳性细胞数高于对照组(P<0.05);④Transwell模型中,实验组处理的神经干细胞从Transwell膜上层迁移到下层的细胞个数高于对照组(P<0.05)。结论小鼠星形胶质细胞外泌体可提高神经干细胞的生存活力。

急性脑卒中患者血清氨基末端B型利钠肽前体水平的变化及其临床意义

目的 :探讨急性脑卒中(脑梗死和脑出血)患者血清氨基末端B型利钠肽前体(amino-terminal pro-B-type natriuretic peptide,NT-pro BNP)水平变化及其与疾病严重程度、预后间的关系。方法 :将急性脑卒中患者分为梗死组(73例)和出血组(46例),并设健康对照组(57名),观察梗死组和出血组患者发病24 h、第(5±2)天和第(12±2)天这3个时段的NT-pro BNP水平、梗死面积、出血量、美国国家卫生研究院卒中评分、格拉斯哥昏迷评分及发病3个月的改良Rankin评分(Modified Rankin Scale,MRS),并分析NT-pro BNP水平与疾病严重程度及发病3个月的MRS评分间的相关性。结果:梗死组患者在24 h、第(5±2)天和第(12±2)天时的NT-pro BNP水平分别为546.78 pg/m L、456.62 pg/m L和176.14 pg/m L;出血组患者分别为458.57 pg/m L、366.31 pg/m L和159.95 pg/m L。不同美国国家卫生研究院卒中评分分数亚组间的NT-pro BNP水平差异有统计学意义(P<0.01)。格拉斯哥昏迷评分与患者入院24 h时的NT-pro BNP水平显著相关(P<0.01)。血清NT-pro BNP水平越高,患者发病3个月的MRS也越高。结论:血清NTpro BNP水平可能是与脑卒中患者病情轻重及预后相关的血清生物学指标。

骨髓间充质干细胞外泌体促进大鼠脑微血管内皮细胞的增殖和迁移

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchyml stem cells, BMSCs)外泌体正常状态下对大鼠脑微血管内皮细胞的增殖和迁移的影响。方法提取大鼠BMSCs并进行鉴定,将其与脑微血管内皮细胞(bEnd.3细胞)通过Transwell小室共培养24 h(BMSCs共培养组);提取BMSCs外泌体进行鉴定,荧光显微镜下定性观察细胞吞噬外泌体的行为,CCK8法检测细胞活力选定最佳BMSCs外泌体工作浓度,将其与bEnd.3细胞共培养24 h(BMSCs外泌体共培养组)。另设bEnd.3细胞单独培养组。培养24 h后通过EDU和细胞划痕实验,分别检测以上3组bEnd.3细胞的增殖和迁移能力。结果第3代BMSCs表面CD90、CD29为阳性,CD45显示为阴性,可成骨、成脂,表明所提取的BMSCs纯度较高。透射电镜下BMSCs外泌体形态为类圆形,直径在100 nm左右;NTA分析发现BMSCs外泌体的直径分布范围为50~600 nm,其中粒径峰值为150 nm;免疫荧光显示内皮细胞能够吞噬BMSCs外泌体;CCK8显示20μg/mL外泌体加入对细胞增殖影响达到最佳。EDU检测显示,相较于对照组,BMSCs共培养组、BMSCs外泌体共培养组均可促进bEnd.3细胞的增殖(P<0.05),且促进增殖的能力相当(P>0.05)。细胞划痕实验示,BMSCs外泌体共培养组细胞的迁移率高于对照组(P<0.05),但与BMSCs共培养组差异不明显(P>0.05)。结论 BMSCs外泌体可代替BMSCs,有效促进脑微血管内皮细胞的增殖和迁移,并为卒中后的血管新生提供新的潜在治疗手段。