相对定量检测HLA-B27 mRNA表达水平的方法建立

目的建立检测HLA-B27 mRNA表达水平的相对定量的方法。方法筛选未经治疗的AS患者外周静脉血27例,其中HLA-B27阳性患者22例,HLA B27阴性患者5例,对标本进行Total RNA提取,然后用RT-PCR方法进行HLA-B27反转录及相对定量。结果22例HLA-B27阳性AS患者有着相对较高的HLA-B27 mRNA表达水平,最低值为1.16,最高值为37.01,均值为7.77。5例HLA-B27阴性AS患者均值为1.19,接近于HLA-B27阴性健康对照组。结论检测外周静脉血HLA-B27mRNA表达水平对检测AS是一种有效可行的方法。

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5′端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针,建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株,未能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞;对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析,与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50/mL,整个试验流程只需2 h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本,两种方法的检出率分别为17.4%和13.5%,两者符合率为95.7%(198/207);荧光RT-PCR的检出率高于ELISA,两者差异显著。结果表明,建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。

炭疽芽胞杆菌染色体特异序列的筛选及实时定量检测

筛选117条炭疽芽胞杆菌（Bacillus anthracis）特异序列，经双重特异性验证后得到19条理想的特异序列（genomic signatures），其中6条符合设计TaqMan探针建立实时定量PCR的要求，根据常规PCR检测结果选择其中CO4片段与炭疽芽胞杆菌毒性质粒pX01、pX02上的pagA、capB基因建立实时定量PCR检测体系。经试验证实这一体系检测灵敏度达到每PCR反应10～100个拷贝。利用12种相关菌株评价后获得100％特异性，对10份模拟污染标本和20份对照标本检测，所有污染标本均被检出，所有对照标本均为阴性。此方法特异、灵敏、高效，在炭疽芽胞杆菌感染的诊断和环境污染的检测等领域有潜在的应用前景。

通用模板PCR技术快速检测乙肝病毒YMDD变异株

目的 探讨快速、安全地检测血清中对拉米夫定耐药的乙型肝炎病毒YMDD变异株。方法 用UT- PCR法结合Taqman荧光探针技术 ,针对HBVcodon 5 5 0位设计两条高度特异性引物Pi和Pv ,并设置保守区对照引物Pc ,在HBV耐药检测中使用了 3管阵列 ,经在PE70 0 0上进行PCR后 ,根据△Cti和△Ctv值 ,来判断是否发生了YVDD和YIDD突变。结果 检测 163例经拉米夫定治疗的病人血清 ,5 1例YMDD变异株阳性 ,其中随机选 15例样本进行DNA测序 ,结果完全相符。结论 本方法具有快速、准确、安全等特点 ,值得推广。

一种高特异性和灵敏性的HBV cccDNA检测方案研究

目的建立一种TaqMan探针的实时PCR检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)方案。方法根据rcDNA与cccDNA结构差异,在缺口两侧设计引物,应用TaqMan探针分析,加入1种可以去除rcDNA和部分扩增产物的依赖ATP的内切酶(Plasmid-Safe ATP-dependent DNase)。结果通过高速离心获得病毒单质颗粒验证了该方案的特异性;通过克隆和酶切得到3.2 kb的环状DNA验证了方案的灵敏性。乙肝患者血清、肝组织cccDNA占总HBV DNA的比例分别为0.03%～0.81%、0.4%～28.0%。结论成功地建立了以TaqMan探针检测血清和肝组织HBV cccDNA的实时PCR检测方法。

连接酶反应检测乙型肝炎病毒阿德福韦耐药突变的初步研究

目的建立一种基于连接酶检测反应(LDR)技术的方法,检测慢性乙型肝炎患者阿德福韦(ADV)耐药突变rtA181V/T和rtN236T。方法设计特异性引物和针对不同突变类型的探针,聚合酶链反应(PCR)扩增后进行LDR,最后在测序仪上分析结果。以直接测序法作为对照分析55例临床标本,对结果不一致的标本进行亚克隆测序确认。结果LDR能够在野生型质粒背景下检测到1%的rtA181V/T或rtN236T突变质粒,不与野生型质粒及血清常见病毒产生交叉扩增。55例临床标本中检测到8例(14.5%)rtA181V/T和rtN236T双突变,6例(10.9%)rtA181V/T单突变,7例(12.7%)rtN236T单突变,与直接测序法结果一致的标本有52例(94.5%)。对3例结果不一致的标本进行亚克隆测序分析,结果与LDR一致。结论LDR是一种特异、敏感的方法,可以用于监测慢性乙型肝炎患者ADV耐药突变。

超高倍显微系统与常规显微镜在阴道分泌物检测中应用的比较

目的探讨超高倍显微镜在阴道分泌物检查方面的意义。方法对1,100例妇科门诊患者分别采用ACT-2000超高倍显微系统和奥林巴斯CX21生物显微进行阴道分泌物检查对照。结果前者显微镜霉菌阳性率为20.27%,后者为11.55%;滴虫阳性率前者为3.0%,后者为2.55%;线索细胞前者为11.27%,后者为0;总的阳性率前者为32.55%,后者为14.09%。结论超高倍显微镜在阴道分泌物检查方面可以明显提高阳性检出率,对临床有较大意义。

3种检测乙型肝炎病毒YMDD变异方法的比较

目的通过多种方法比较分析找到一种高灵敏的检测乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的方法。方法收集抗病毒治疗1年的慢性乙肝患者样本166例(116例采用拉米夫定治疗、50例采用替比夫定治疗),比较高温连接酶检测反应(LDR)、实时荧光聚合酶链反应(Real-time PCR)和测序3种方法检测HBV YMDD变异灵敏性。结果 LDR、Real-time PCR、测序的阳性率分别为23.49%、21.68%、19.27%。3种方法的特异性均为100%。采用拉米夫定治疗的患者中有38例变异,其中YIDD12例、YVDD26例;替比夫定只有1例YIDD变异。结论 LDR方法检测YMDD变异是非常适合临床应用的方案。YVDD变异较YIDD变异更为普遍。

拉米夫定和α-干扰素序贯治疗对慢乙肝患者拉米夫定耐药突变的抑制作用

目的评价拉米夫定和α-干扰素序贯治疗e抗原阴性的慢乙肝患者的疗效。方法将162例e抗原阴性的慢性乙肝患者随机分成两组,对照组单用拉米夫定100 mg/d,治疗48周;观察组先给予拉米夫定100 mg/d,20周后加用α-干扰素500万U、3次/周,4周后改为单用α-干扰素,治疗24周。完成上述治疗后,对照组给予拉米夫定、观察组给予α-干扰素继续巩固治疗24周。观察两组的病毒学和生化应答以及拉米夫定抗性突变情况。结果治疗48周后,对照组ALT水平复常和HBV DNA降至1 000 copies/ml以下的患者比例分别为55.1%和55.1%,观察组分别为59.36%和56.25%。两组比较无统计学差异(P>0.05)。观察组治疗24周时发生YIDD突变2例,治疗结束时消失;对照组发生YMDD突变22例。结论采用拉米夫定与α-干扰素序贯治疗慢性乙肝患者与单用拉米夫定同样有效,序贯治疗更能抑制拉米夫定耐药突变的产生。

国内HPV DNA检测的常见方法比较

人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌的主要致病元凶,研究表明99.7%的宫颈癌患者存在HPV感染[1]。由于HPV感染与宫颈癌的高度相关性,而HPV阴性者几乎不会发生宫颈癌。而且HPV感染与宫颈癌的发生有时序关系,

PCR-LDR检测EGFR变异的初步研究

目的研究PCR-连接酶检测反应(Ligase detection reaction,LDR)技术对EGFR变异检测的可行性。方法运用多重PCR和多重LDR的技术原理,根据EGFR基因19、20和21外显子4个变异位点,设计引物、探针,研究最适反应条件;同时构建相应阳性质粒,比较PCR-LDR法与测序法的一致性。结果利用测序法验证了PCR-LDR法检测EGFR变异的准确性。检测32份临床样本,其中10份样本出现EGFR变异。结论PCR-LDR法检测EGFR变异可以用于临床样本的检测。

实时荧光PCR监测HBV感染患者拉米夫定治疗病毒YMDD变异

目的 建立一种快速准确的实时荧光PCR方法检测HBV感染患者经拉米夫定治疗后YMDD变异情况。方法 首先用PCR法筛选HBVDNA阳性血清157例，HBVDNA含量为2．0×10^3-8．0×10^8拷贝／ml，HBVDNA阴性血清30例，然后采用TaqMan探针技术和选择性引物的实时荧光PCR对其进行YMDD变异检测。通过变异株和对照管的循环阈值（cyclethreshold，Ct值）差来计算血清中总HBV中的YMDD变异株含量，并用PCR产物直接测序方法随机对69例HBVDNA阳性标本RT区进行基因序列分析，验证所建立方法的准确性。结果 187例接受拉米夫定治疗患者血清标本中，发生YMDD变异88例，其中YIDD变异39例，YVDD变异38例，YIDD与YVDD混合变异11例。突变株的含量为10％～100％。30例HBVDNA阴性血清的C管循环40次，69例测序结果显示68例两种方法检测结果完全相同，符合率为98．55％。结论 采用选择性引物和TaqMan探针技术建立实时荧光PCR方法能快速准确地检测YMDD变异情况，并能检测患者变异株在HBV总量中的比例，为临床使用拉米夫定治疗乙型肝炎病毒感染监测耐药性提供一种有效方法。

HBV感染对HIV-1病人抗病毒药物治疗影响的初步分析

目的了解合并乙型肝炎病毒(HBV)感染及其基因亚型对艾滋病病毒1型(HIV-1)病人抗病毒药物治疗疗效的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测HBV基因型,根据分型情况进行组内比较。调查病人纳入治疗组时和进行抗病毒治疗(ART)6个月、12个月、24个月以及36个月后各项临床指标。结果共收集46份HIV-1、HBV合并感染病人的标本,以50份单独感染HIV-1病人的标本作为对照。46例共感染病人中,共检出30例B基因型,其余为非B基因型。每组病人经过治疗后,CD4细胞计数值均明显上升,肝脏生化酶指标均明显下降。比较B型与非B型病人的肝、肾功能指标,在治疗前期差异有统计学意义;但其他病毒学应答在ART治疗6个月、12个月、24个月以及36个月时,差异无统计学意义,比较单独感染HIV-1和HIV-1/HBV合并感染病人在治疗过程中的血小板变化,治疗6个月时的血肌酐,以及治疗12个月时的血红蛋白值,差异有统计学意义,其他病毒学应答无统计学意义。结论 ART治疗可明显提升共感染病人的免疫水平,促进丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)恢复正常,使病人病情好转。是否感染HBV和所感染HBV的基因型,在短期内可能影响到HIV-1病人的部分临床应答,但这种影响会随着治疗的深入而逐渐消失。

人巨细胞病毒的定量检验和临床意义

人巨细胞病毒(HCMV)是一种普遍存在的DNA病毒,在免疫系统不成熟或受损的患者中会导致严重的疾病。最近几年,HCMV的定量检测已成为临床上帮助确定抗病毒治疗方案、评估治疗方案疗效和找出耐药性案例的主要方法。这篇综述对HCMV的不同定量方法进行了比较并对如何改善临床诊断做了一些探讨。

HBeAg阴性的慢性HBV感染者乙肝病毒前C区G1896A变异分析

目的:了解HBeAg阴性的慢性HBV感染者乙肝病毒前C区G1896A变异情况,为临床乙肝诊治提供科学依据。方法:北京市海淀医院HBeAg阴性的慢性HBV感染者496例,其中HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者380例,非活动期HBV感染者196例,取血液及肝组织样本进行HBV血清学标志检测(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc)、丙氨酸谷丙转移酶(ALT)、HBV DNA定量检测;HBV前C区G1896A变异检测;肝组织学检查;采用SPSS13.0软件进行数据分析。结果:两组患者血清中均检测到HBV DNA,其中HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者组检出率100%(296/296),平均值为4.90±1.49log10拷贝数/毫升,非活动期HBV感染者组检出率42.0%(84/200)平均值为3.22±0.59 log10拷贝数/毫升,两组比较HBV DNA载量差异有显著性;在HBV DNA载量>1000拷贝/ml的病例中HBeAg阴性慢性乙型肝炎组的乙肝病毒存在前C区G1896A变异,发生率为83.8%(248/296),非活动期HBV感染组乙肝病毒前C区G1896A也存在变异,发生率为33.3%(28/84),两组变异发生率比较差异有显著性;非活动期HBV感染者组中存在HBV前C区G1896A变异患者6个月后有2例ALT和HBV DNA载量较前升高。结论:e-抗原阴性慢性HBV感染者存在变异,前C区G1896A变异所导致HBeAg表达水平低下或不表达,但仍有HBV DNA活动性复制,临床诊疗中要予以充分重视。

关于HCMV潜伏感染与激活感染研究的新进展

人巨细胞病毒(HCMV)是疱疹病毒科中最大的病毒,结构复杂,其感染在人群中非常普遍,近年来免疫妥协(immunocompromised)群体尤其是移植群体中的HCMV潜伏感染和激活感染越来越受到临床重视。本文就HCMV的感染与免疫、HCMV的致病机制、宿主的抗感染与免疫、HCMV的免疫逃逸、HCMV的潜伏与激活及HCMV相关研究的困境与展望近年来此方面研究新进展作一简要综述。

丙型肝炎病毒基因分型研究进展及临床意义

丙型肝炎是经血或血制品传播的急慢性肝炎类疾病,可转化为肝硬化或肝癌。其致病因子丙型肝炎病毒是一种高异质性RNA病毒,可根据其基因变程度的不同分为多个基因型与亚型,其基因分型与地理分布,病情进展及干扰素的治疗效果有关,近年来发展出了多种检测基因分型的方法。本文就近年来丙型肝炎基因分型的各种检测方法作一比较并综述了基因分型的临床意义,为临床对各种检测方法的选择提供一定的依据。

检测低拷贝数HBV DNA含量的临床研究

目的:了解不同试剂在应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)以及巢式PCR方法在检测低拷贝数的HBV DNA量的差异与灵敏度。方法:用上海复星医学科技发展有限公司(A方法)检测出了68例HBV DNA结果为5.1×101-1.0×103拷贝数/亳升的低拷贝数标本。然后,三家不同公司的试剂(方法 B、方法 C、方法 D)对这些样本进行复核。另外,巢式聚合酶链反应PCR法检测此68例标本。随访巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA的病人。结果:用四种方法(A、B、C、D)检测的68个样本的HBV DNA拷贝数结果如下:无拷贝(0,9,12,4);101-102(21,17,18,22);102-103(47,36,28,35),大于103(0,6,10,7)。同时,用巢式聚合酶链反应检测此68例标本,有55例检测为阳性,有13为阴性结果。巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA含量的病人,随访发现此10病人有8例均在1~3月后出现HBV DNA的反跳,并伴肝功能的不正常,其HBV DNA的含量均在104拷贝数/毫升以上。结论:目前所用的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)的方法和试剂对低拷贝数HBV DNA存在不稳定性和不确定性。巢式PCR法对低拷贝数HBV DNA的检测灵敏度要远高于实时荧光定量PCR法。该研究提示测对抗病毒治疗过程中患者进行低拷贝数HBV DNA的检将提供有效的药物评价和预后信息。

实时荧光定量PCR检测HPV-DNA在宫颈癌筛查中应用

目的:探讨HPV感染与宫颈病变的关系。方法:对2008年2月-2009年3月期间在通山县人民医院皮肤性病科和妇科门诊就诊的1256位女性的宫颈拭子标本进行HPV DNA实时荧光定量PCR检测,比较不同宫颈病变级别组HPV的阳性率。结果:各病变组与正常组比较差异有显著性,P<0.01,且随病变级别增加总阳性率逐渐上升。结论:HPV在人群具有较高的感染率,且HPV感染与宫颈病变的发生有关。实时荧光定量PCR检测HPV DNA可成为一种广泛应用的临床检验技术,作为筛查宫颈癌及癌前病变的首选方法。