美洲大蠊粪便中微生物的分离和鉴定及其抗菌活性分析

【目的】探究美洲大蠊Periplaneta americana粪便中具有抗菌活性的真菌和放线菌,为抗菌药物的开发提供微生物来源。【方法】利用稀释涂布法与选择培养法,从云南省大理白族自治州巍山县美洲大蠊养殖场收集的美洲大蠊成虫粪便中分离纯化放线菌和真菌;采用牛津杯琼脂扩散法检测菌株代谢产物对6种病原细菌大肠杆菌Escherichia coli、粪肠球菌Enterococcus faecalis、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus)、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium的抗菌活性;通过16S rDNA和ITS rDNA基因测序鉴定抗菌活性菌株,并利用邻接法构建抗菌活性菌株系统发育树。【结果】从美洲大蠊成虫粪便中分离出真菌17株,放线菌19株。共有6株真菌和12株放线菌表现出不同程度的抗菌活性,其中真菌EPAF15-EPAF17及放线菌EPAA12和EPAA17对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌表现出较为广谱的抗菌活性。系统发育分析显示,具有抗菌活性的真菌隶属于镰刀菌属Fusarium、生丝毕赤酵母属Hyphopichia和丝孢酵母属Trichosporon;具有抗菌活性的放线菌隶属于链霉属Streptomyces。【结论】美洲大蠊成虫粪便中具有种类丰富的可培养微生物,其中的抗菌活性真菌和放线菌的发现不仅能作为进一步深入挖掘新型抗菌活性天然药物的重要微生物储备资源,也为特境微生物资源的充分利用提供了新的思路。

美洲大蠊提取物PAS840的乙酰胆碱酯酶活性抑制作用及抗氧化能力观察

目的探讨美洲大蠊提取物PAS840的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制活性和抗氧化活性。方法根据预实验确定最佳酶促反应条件得到的数据,AChE浓度为0.425U/mL、底物碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)浓度为15mmol/L、反应时间为20min,采用改良的Ellman法进行酶促反应,检测不同浓度(7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250μg/mL)PAS840对AChE催化ATCI分解的抑制率,计算其半数抑制浓度(IC_(50)),采用米氏方程相关的酶动力学实验测定PAS840对AChE的抑制类型。取不同浓度的PAS840溶液或维生素C(VC),采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法检测其对DPPH自由基的清除率,采用总还原能力测定法检测其对铁氰化钾的还原率,采用水杨酸法检测其对羟自由基的清除率,并计算相关的IC_(50)。结果PAS840对AChE催化反应进程具有抑制作用,且随着PAS840作用浓度增加和时间延长,其抑制作用更为明显;随着PAS840作用浓度增加,AChE抑制率先逐渐升高再趋于平缓。PAS840抑制AChE催化ATCI分解的IC_(50)为22.30μg/mL,其抑制类型是混合性抑制。随着浓度的增加,PAS840、Vc对DPPH自由基的清除率均呈先升高后平稳的趋势;500μg/mLPAS840对DPPH自由基的清除率为93.95%,同等浓度Vc的清除率为97.31%;PAS840清除DPPH自由基的IC_(50)为43.21μg/mL。随着浓度的增加,PAS840对铁氰化钾的还原率呈先升高后平稳的趋势,Vc对铁氰化钾的还原率呈比较高的平稳趋势;3.0mg/mLPAS840对铁氰化钾的还原率为93.95%,同等浓度Vc的还原率为82.2%;PAS840还原铁氰化钾的IC_(50)为0.498mg/mL。随着浓度的增加,PAS840对羟自由基的清除率呈比较中等的平稳趋势,Vc对羟自由基的清除率呈逐渐升高趋势;1.8mg/mLPAS840对羟自由基的清除率为45.72%,其后逐渐趋于平缓,同等浓度Vc的清除率为74.06%;3.0mg/mLPAS840对羟自由基的清除率为47.83%,同等浓度Vc的清除率为89.73%;PAS840清除羟自由基的IC_(50)为3.65mg/mL。结论PAS840具有较强的AChE活性抑制作用和抗氧化能力。

赖氨酰氧化酶样蛋白4在肝细胞癌中的表达及其预后相关性分析

利用生物信息学分析人赖氨酰氧化酶样蛋白4(1ysyl-oxidase like 4,LOXL4)基因在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及临床意义,为HCC的诊治提供新的思路。基于癌症基因图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库和人类蛋白表达图谱(thehumanproteinatlas,HPA)数据库分析LOXL4在HCC组织和正常肝组织中的表达差异,分析LOXL4与HCC患者临床病理特征的相关性并进行可视化分析;通过GEPIA数据库及构建Cox回归模型分析LOXL4表达与患者预后关系;分析LOXL4与HCC肿瘤标志物基因的相关性;STRING在线数据库构建LOXL4蛋白质相互作用网络;TIMER数据库分析LOXL4基因与肿瘤免疫浸润的关系。数据库分析结果表明LOXL4在HCC中表达水平显著升高,且LOXL4表达与HCC患者的病理分级呈正相关。生存分析和Cox回归分析显示LOXL4高表达提示HCC患者预后较差。HCC中TRPV4、INHBE、ITGB5和BCL7A与LOXL4的表达呈正相关,SOD1、ADI1、HINT2和HAGH与LOXL4的表达呈负相关。LOXL4与HCC肿瘤标志物GPC3和CK19的表达呈正相关,与ARG1和CD10的表达呈负相关。LOXL4与LOX、BMP1、TLL1等10种蛋白质存在相互作用。LOXL4表达与肿瘤细胞纯度及多种免疫细胞浸润具有显著相关性。本研究揭示了LOXL4在HCC中表达上调且与HCC患者预后不良、免疫浸润及多种HCC诊断标志物密切相关,其有望成为HCC的早期筛查、诊断及预后评估的重要生物靶标。

药用昆虫喙尾琵琶甲肠道抗菌活性放线菌的筛选及鉴定

【目的】探究药用昆虫喙尾琵琶甲Blaps rynchopetera肠道具有抗菌活性的放线菌,为抗菌药物开发提供新的放线菌资源。【方法】结合稀释涂布法和选择培养法从喙尾琵琶甲成虫肠道分离放线菌。以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methieillin-resistant Staphylococus aureus)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌Escherichia coli、粪肠球菌Enterococcus faecalis、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 6株致病细菌以及黑曲霉Aspergillus niger、青霉菌Penicillium expansum和白色念珠菌Canidia albicans 3株致病真菌为指示菌,通过牛津杯琼脂扩散法测试放线菌次生代谢产物的抗菌活性。随后,采用分子生物学方法进行16S rRNA序列分析鉴定活性显著的18株放线菌并构建系统发育树。【结果】从喙尾琵琶甲成虫肠道中分离到176株共生放线菌,初步活性筛选结果显示其中46株放线菌表现出不同程度的抗菌活性。多株放线菌对致病菌具有广谱的抑菌作用且抑菌圈直径超过阳性对照药。选择抑菌圈直径大于15 mm的18株放线菌进行分子鉴定,结果显示均为链霉菌属Streptomyces。【结论】喙尾琵琶甲肠道含有丰富的抗菌活性放线菌资源。

喙尾琵琶甲肠道来源真菌的分离及其次级代谢产物的抗菌、抗肿瘤活性筛选

目的研究药用昆虫喙尾琵琶甲Blaps rynchopetera成虫肠道的活性真菌,为抗菌、抗肿瘤活性天然产物的开发提供新的真菌资源。方法结合稀释涂布法和选择培养法对喙尾琵琶甲成虫肠道的真菌进行分离纯化;以9株病原菌为指示菌,通过牛津杯琼脂扩散法检测肠道真菌次级代谢产物的抗菌活性;结合形态学,通过分子生物学方法进行ITS序列比对,鉴定抗菌活性显著的真菌并构建系统发育树;采用5株肿瘤细胞,对已鉴定的菌株进行抗肿瘤活性测试。结果从喙尾琵琶甲肠道中分离获得108株真菌,其中17株真菌具有不同程度的抗菌活性;选择7株抑菌活性显著(抑菌圈直径≥14 mm)的真菌进行鉴定;研究还显示3株真菌的次级代谢产物具有广谱的抗肿瘤活性。结论喙尾琵琶甲肠道来源真菌的次级代谢产物具有一定的抗菌及抗肿瘤活性。

人乳腺癌组织中线粒体转录终止因子3的表达及其临床意义

目的:阐明线粒体转录终止因子3(mitochondrial transcription termination factor 3,MTERF3)在乳腺癌中的表达及其与患者临床病理特征、预后的相关性。方法:使用免疫组化SP法对58例乳腺癌组织及配对癌旁组织中MTERF3蛋白的表达水平进行检测。通过R 4.2.0软件获取癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中705例乳腺癌患者的MTERF3 mRNA表达数据集、临床病理信息及预后资料,差异分析MTERF3表达量与乳腺癌患者临床病理参数之间的相关性,并使用UALCAN数据库进行可视化分析。使用Kaplan-Meier法计算患者的总体生存率和无疾病进展生存率,Cox回归分析影响乳腺癌患者预后的临床病理因素。结果:MTERF3蛋白主要表达于细胞质,且乳腺癌组织阳性表达率(91.38%)明显高于乳腺癌癌旁组织(20.69%),两组间阳性率具有显著差异(P<0.01)。TCGA数据集研究表明,MTERF3与乳腺癌患者的ER状态、PR状态、乳腺癌分子分型、癌症类型、组织学诊断及原发部位存在显著相关性(均P<0.05),但与患者的年龄、性别、T分期、N分期、M分期、AJCC病理分期、HER2状态以及有无恶性肿瘤病史无关。MTERF3与乳腺癌患者的总体生存时间和无疾病进展生存时间无关(P> 0.05)。Cox多因素分析提示,年龄、M分期和病理类型可能是导致乳腺癌患者预后不良的独立危险因素(P <0.05)。结论:MTERF3蛋白在乳腺癌组织中的表达阳性率和表达量均显著增高,提示MTERF3可能与乳腺癌的发生过程密切相关,该基因有望成为乳腺癌患者临床诊断和治疗的潜在基因靶点。

抗肿瘤活性美洲大蠊肠道共生放线菌的筛选及其鉴定

本研究对41株美洲大蠊肠道共生放线菌进行抗肿瘤活性筛选,并对具有显著抗肿瘤活性的放线菌进行分子生物学鉴定,经BLAST同源比对后建立系统发育树。抗肿瘤活性放线菌筛选结果表明:在样品浓度为100μg/mL时,6株放线菌对4种供试肿瘤细胞呈现不同的抑制活性,其中4株对4种肿瘤细胞均具有显著的抑制作用。经16S rRNA鉴定,结果显示:6株放线菌均被鉴定为链霉菌属。本研究揭示了美洲大蠊肠道含有丰富的抗肿瘤活性的放线菌资源,这为后续进一步挖掘新型抗肿瘤化合物提供重要的微生物资源。

美洲大蠊成虫肠道抗细菌共生放线菌的筛选及鉴定

【目的】鉴于野外美洲大蠊Periplaneta americana对恶劣环境适应性强,本研究旨在从云南省大理州的野外美洲大蠊成虫肠道中分离、筛选出抗细菌活性放线菌,为抗生素开发提供菌种资源。【方法】采用涂布平板法和平板划线法对美洲大蠊成虫肠道放线菌进行分离;以金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、粪肠球菌Enterococcus faecalis、大肠杆菌Escherichia coli和鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium共6种人体病原细菌为指示菌株,采用牛津杯法对分离自这些放线菌的次生代谢产物进行抗菌活性测定;通过形态学特征和16S rRNA基因序列分析,对具有广谱和明显抗菌活性的放线菌进行鉴定,并经16SrRNA基因序列的BlAST同源性比对及系统发育分析确定它们的分类地位。【结果】从美洲大蠊成虫肠道共分离获得41株放线菌。抗菌活性测定结果表明,34株(82.9%)放线菌对至少1种指示病原细菌具有抑制作用,其中有7株对3种以上病原细菌具有抑制作用,9株表现出明显的抗菌活性。根据系统发育分析结果,这些放线菌均被鉴定为链霉菌属Streptomyces spp.。【结论】野外美洲大蠊成虫肠道含有丰富的抗细菌活性的放线菌资源,为后续挖掘新型抗生素提供重要的微生物资源。

喙尾琵琶甲肠道来源链霉菌(Streptomyces sp.)BPA71次级代谢产物的分离鉴定及其生物活性评价

【背景】昆虫是世界上种类最多、肠道菌群资源最丰富且多样的动物类群之一。昆虫肠道微生物具有产生活性次级代谢产物的能力,是活性天然产物的重要来源。【目的】研究药用昆虫喙尾琵琶甲(Blaps rynchopetera)成虫肠道来源链霉菌(Streptomyces sp.)BPA71的次级代谢产物及其生物活性。【方法】利用正相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱等方法分离纯化该菌株的发酵粗提物,采用牛津杯法进行抗菌活性追踪,确定抗菌活性部位,通过ESI-MS、NMR等波谱数据分析对化合物结构进行鉴定,采用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),采用MTS法测定抗肿瘤活性。【结果】从Streptomyces sp.BPA71的固体发酵提取物中共分离得到4个已知化合物,通过对比核磁数据确定为糠酸甲酯(1)、吡咯甲酰胺A(2)、吡咯甲酰胺B(3)和吲哚-3-乙酸甲酯(4)。抗菌活性结果显示化合物2具有广谱抗菌活性。此外,化合物2对宫颈癌细胞HeLa、肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMC-7721、乳腺癌细胞MDA-MB-231和结肠癌细胞SW480这5株肿瘤细胞均有明显的抑制活性。【结论】喙尾琵琶甲肠道来源Streptomyces sp.BPA71可产生丰富的生物活性物质,该研究结果为进一步挖掘喙尾琵琶甲肠道链霉菌的活性天然产物奠定了基础,同时丰富了人们对喙尾琵琶甲肠道微生物的认识。

赖氨酰氧化酶家族蛋白质与乳腺癌发生发展相关性的研究进展

赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)家族蛋白质是一类分泌型铜依赖性胺氧化酶,可以催化细胞外基质(extracellular matrix, ECM)中的胶原蛋白和弹性蛋白的共价交联,调节组织抗张强度,在ECM的形成和修复中发挥关键作用。此外,LOX家族蛋白质的异常表达和调控会导致多种不同类型癌症的发生,例如肺癌、肝细胞癌、胃癌、肾细胞癌、结直肠癌等。近年的研究显示,LOX家族蛋白质在乳腺癌中的表达显著上调,参与了乳腺癌的增殖、侵袭和转移。且LOX家族蛋白质的高表达与乳腺癌患者的预后不良密切相关。本文主要总结了LOX家族蛋白质的结构、功能及其在乳腺癌发生和转移中的机制,为乳腺癌的临床诊断和治疗以及筛选有效的LOX特异性抑制剂提供理论基础和参考依据。

哺乳动物三角状五肽重复蛋白家族在线粒体基因表达调控中的研究进展

三角状五肽重复(pentatricopeptide repeat,PPR)蛋白通常包含2~27个串联重复的结构域,每个结构域含有35个氨基酸残基。PPR蛋白是一类广泛存在于真核生物体内的RNA结合蛋白,对单链RNA具有序列特异性识别模式,与RNA的转录、剪切、编辑、稳定性及翻译等过程密切相关。迄今为止,在哺乳动物中仅发现7个PPR蛋白,它们均存在于线粒体中,包括线粒体RNA聚合酶(mitochondrial RNA polymerase,POLRMT)、富含亮氨酸的三角状五肽重复结构蛋白(leucinerich pentatricopeptide repeat-containing protein,LRPPRC)蛋白、线粒体核糖体小亚基蛋白27(mitochondrial ribosomal protein of the small subunit 27,MRPS27)、线粒体核糖核酸酶P蛋白3(mitochondrial RNase P protein 3,MRPP3)以及五肽重复结构域蛋白(pentaricopeptide repeat domain protein,PTCD)1~3。哺乳动物PPR蛋白家族的成员在线粒体转录、RNA代谢和翻译中具有多种调控作用,对于线粒体功能和细胞健康至关重要。本文简要概述了哺乳动物细胞中PPR蛋白家族7个成员的结构和亚细胞定位,探讨了PPR蛋白在线粒体基因表达调控中的作用,并展望了PPR蛋白对人类线粒体相关疾病的应用前景。

美洲大蠊多肽逆转人肝癌HepG2/ADM细胞多药耐药性的作用及机制研究

目的探讨美洲大蠊多肽(PAE_(2))逆转人肝癌多药耐药细胞株HepG2/ADM的作用及机制。方法噻唑蓝(MTT)法检测HepG2/ADM细胞对不同化疗药物的耐药性以及PAE_(2)联合化疗药物(5-氟尿嘧啶、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、奥沙利铂)对HepG2/ADM细胞增殖的影响;激光共聚焦观察PAE_(2)对HepG2/ADM细胞中药物累积的影响;Western blotting法检测PAE_(2)对HepG2/ADM细胞凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X,Bax)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase 9,Caspase-9)、DNA修复酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)表达的影响;qRT-PCR法检测PAE_(2)对多药耐药蛋白1(multiple drug resistance 1,MDR1)、乳腺癌耐药相关蛋白(breast cancer resistant protein,BCRP)和酶介导的多药耐药途径中蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、拓扑异构酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ,TopⅡ)的m RNA表达。结果PAE_(2)抑制Hep G2/ADM细胞增殖,呈时间和剂量相关性。PAE_(2)可逆转Hep G2/ADM对不同化疗药物的耐药性;PAE_(2)可上调Hep G2/ADM细胞中阿霉素水平,呈剂量相关性。PAE_(2)可显著上调耐药细胞中Bax、cleaved Caspase-9 p37蛋白表达水平(P<0.05、0.01),显著下调Bcl-2蛋白表达水平(P<0.01),对cleaved PARP蛋白表达无显著影响。PAE_(2)均显著下调Hep G2/ADM细胞中MDR1、BCRP、PKC、TopⅡm RNA水平(P<0.01)。结论PAE_(2)可以通过减少药物外排、促进细胞凋亡、下调耐药蛋白表达等途径逆转Hep G2/ADM细胞的多药耐药性。

美洲大蠊多肽PAE_(2)对人肝癌BEL-7402和BEL-7402/5-FU裸鼠皮下移植瘤侵袭转移的影响

目的 基于腺苷酸活化蛋白激酶靶点在动物水平上探讨美洲大蠊多肽PAE;逆转肝癌多药耐药细胞BEL-7402/5-FU的机制研究。方法 以Balb/c-nude裸鼠为实验对象,建立裸鼠皮下人肝癌BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞瘤模型(敏感肝癌细胞模型和耐药肝癌细胞模型)。将裸鼠分为正常组、敏感组(敏感肝癌细胞模型)、耐药组(耐药肝癌细胞模型),索拉菲尼组(耐药肝癌细胞模型,给予30 mg·kg^(-1)阳性药索拉菲尼)和高、中、低剂量实验组(耐药肝癌细胞模型,分别给予200,100,50 mg·kg^(-1)多肽PAE_(2))。计算裸鼠抑瘤率及脏器指数;以生化分析仪检测裸鼠生化指标;以苏木精-伊红(HE)染色法观察肿瘤组织及肝组织的病理学变化;以实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测肿瘤组织中侵袭转移相关因子mRNA表达水平。结果 敏感组、耐药组、索拉菲尼组和高、中、低3个剂量实验组MMP2表达水平分别为0.01±0.00,1.00±0.00,0.02±0.01,0.01±0.01,0.07±0.02和0.00±0.00;这6组的MMP9表达水平分别为0.01±0.02,1.00±0.00,0.18±0.08,0.01±0.00,0.04±0.01和0.00±0.00;这6组的4EBP1表达水平分别为0.23±0.08,1.00±0.00,1.80±0.30,0.20±0.06,0.66±0.16和0.12±0.06。PAE;组与耐药组相比,各项mRNA表达水平均明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论 美洲大蠊多肽PAE_(2)可通过腺苷酸活化蛋白激酶靶点影响裸鼠肿瘤细胞的侵袭转移因子,降低肿瘤组织中MMP2等mRNA的侵袭,从而抑制裸鼠肿瘤的生长。