分泌EphrinAl-Caspase-3的T淋巴细胞对裸鼠乳腺癌组织生长的抑制作用

目的探讨分泌Ephrin Al-Caspase-3的T淋巴细胞体内移植对癌细胞的抑制作用。方法将裸鼠(n=35)接种乳腺癌细胞,构建裸鼠乳腺癌模型。待肿瘤体积达到0.1 cm3大小,选取30只具有平均大小瘤组织的裸鼠随机分为PBS组、未感染腺病毒组、感染Ad-EphrinA1-Caspase-3的T淋巴细胞组,经瘤内移植,每隔2~3 d测量肿瘤大小。另选取3组荷瘤裸鼠,经上述细胞移植后,每隔2~3 d获取裸鼠皮下肿瘤组织匀浆,ELISA检测Ephrin A1-Caspase-3的含量。实验结束后各组动物断颈处死剥离肿瘤制成切片,在荧光显微镜下观察表达绿色荧光蛋白的T淋巴细胞,免疫荧光法进行Caspase-3、Ki-67的检测。结果乳腺癌细胞接种裸鼠1周后可用手摸到皮下肿瘤,证明乳腺癌细胞荷瘤动物模型制做成功。接种后第8天各组裸鼠肿瘤体积差异变大,治疗组与PBS组/T淋巴细胞组相比差异极显著(P<0.05)。单纯T淋巴细胞移植组肿瘤体积虽较PBS对照组生长缓慢,但两者间并无明显统计学差异。Ephrin A1-Caspase-3治疗组第2天可以检测出Ephrin A1-Caspase-3的表达,第8天达到高峰,随后分泌量逐渐降低。PBS对照组和T淋巴细胞组未检测到Ephrin A1-Caspase-3的表达。在治疗组肿瘤组织中观察到分散的绿色荧光蛋白标记的Ephrin Al-Caspase-3-T淋巴细胞,而在PBS组和T淋巴细胞组中未检测到绿色荧光蛋白的存在。治疗组感染细胞中,Caspase-3阳性细胞比例上调,Ki-67阳性细胞比例下调。在PBS组和T淋巴细胞组未检测到Ephrin Al-Caspase-3的表达。结论Ephrin Al-Caspase-3可显著抑制乳腺癌细胞的生长,发挥抗肿瘤效应。

EphA2受体与恶性肿瘤关系的研究进展

促红细胞生成素产生肝细胞受体（erythropoietin producing hepatocyte receptor，Eph）家族是己知最大的受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）亚家族之一，现有14个成员，其配体名为Ephrin，即Eph家族受体相互作用蛋白，现有8个成员。

EphrinA1-caspase-3对乳腺癌细胞的体外靶向性抑制作用

目的:研究重组EphrinA1-caspase-3对体外乳腺癌细胞是否有靶向性抑制作用。方法:将重组EphrinA1-caspase-3感染人乳腺细胞,MTT法检测重组Ad-EphrinA1-caspase-3感染上清对EphA2阳性乳腺癌细胞的体外增殖的影响,采用流式细胞仪检测Ad-EphrinA1-caspase-3感染上清对乳腺癌细胞凋亡的影响,采用抗体中和实验检测感染上清中EphrinA1-caspase-3对靶细胞杀伤效应的特异性。结果:乳腺癌细胞呈贴壁生长,细胞中可见高水平的EphA2受体及EphrinA1表达。Ad-EphrinA1-caspase-3感染上清对乳腺癌细胞增殖表现出强烈的抑制作用,生长抑制率达48.9%。用流式细胞仪检测培养72h后稀释倍比为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16上清对应的凋亡率分别为36%、24%、18%、8%、7%,显著高于对照组凋亡率4%,且中和抗体能有效的减弱重组EphrinA1-caspase-3对EphA2阳性乳腺癌细胞的杀伤作用。结论:感染EphrinA1-caspase-3的T淋巴细胞能够对体外乳腺癌细胞起到靶向性抑制作用。

携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体的构建和包装

目的:构建携带ephrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体,通过包装、扩增、鉴定,为后续开展目的基因靶向治疗乳腺癌研究奠定基础。方法:以pMD18T-Casp3、pMD18T-EphrinA1为模板扩增caspase-3、EphrinA1基因,以pET28a为载体,通过双酶切、连接、转化、测序鉴定,构建pET28a-EphrinA1-Casp3。然后以质粒pEC3.1(+)为载体,获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3。采用LR体外同源重组,构建pAd-EphrinA1-Casp3,以HEK293包装和放大培养。结果:成功将PCR扩增的EphrinA1胞外端基因和人活性型caspase-3基因定向克隆入质粒pET28a,并将EphrinA1-caspase-3融合基因转移到穿梭质粒pEC3.1(+),获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3载体;经过体外同源重组,成功构建携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3;并在HEK 293细胞中完成包装和扩增;获得重组腺病毒rAd-EphrinA1-Casp3。结论:利用GatewayTM技术成功构建重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3,经HEK293细胞包装,获得重组腺病毒rAdEphrinA1-Casp3。

分泌ephrinAl-caspase-3的T淋巴细胞株的建立

目的培养T淋巴细胞,研究其被pAd-ephrinAl-caspase-3重组腺病毒感染后的表达情况。方法通过细胞培养方法培养T淋巴细胞,将构建好的重组腺病毒感染T淋巴细胞,用间接免疫荧光检测T淋巴细胞的感染效率;用MTT法检测T淋巴细胞增殖和毒性;用定量PCR和ELISA检测ephrinAl-caspase-3的表达量。结果成功培养了T淋巴细胞且被重组腺病毒感染后,ephrinAl和caspase-3表达增高;随着MOI的升高,细胞的生存数量减少、细胞增殖活力下降(P<0.05),而且具有时间和剂量依赖性。结论分泌ephrinAl-caspase-3的T淋巴细胞构建成功。