离子对反相高效液相色谱法同时测定大鼠血浆和红细胞中外源性磷酸肌酸及其代谢产物和相关三磷酸腺苷

建立了离子对反相高效液相色谱(IP-RPHPLC)同时测定大鼠血浆和红细胞(RBC)中磷酸肌酸(PCr)及其代谢产物肌酸(Cr)以及相关三磷酸腺苷(ATP)浓度的方法。采用Kromasil-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相A:0.2%KH2PO4+0.08%四丁基硫酸氢铵混合溶液(pH3.0);流动相B:0.2%KH2PO4+0.08%四丁基硫酸氢铵混合溶液(以1mol/LNaOH调至pH7.5);流动相C:甲醇。梯度洗脱,同时改变流速和检测波长。血浆及RBC样品以HClO4沉淀蛋白予以净化。选用甲氧苄啶(TMP)为内标,以峰面积比内标法进行定量分析,以基线扣除法计算外源性PCr、Cr和相关ATP浓度。在上述色谱条件下,血浆及RBC中PCr、Cr、ATP及TMP达基线分离,不受基质干扰,PCr在10～7500mg/L(血浆)、10～2500mg/L(RBC),Cr和ATP在10～1500mg/L(血浆)、10～750mg/L(RBC)范围内线性关系良好(r2>0.99);3种分析物QC样品的日内和日间精密度(RSD)均小于10%;回收率均大于92%。采用本方法测定了静脉和口服给药PCr后大鼠血浆和RBC中3种分析物浓度,结果满意。

体外肝细胞的制备及在药物开发中的应用

体外肝细胞模型(主要是原代肝细胞培养)作为一种强有力的体外研究体系被广泛应用于化学异物的肝毒性研究。由于肝细胞具有Ⅰ相、Ⅱ相药物代谢酶和药物转运载体,肝细胞被应用于药代动力学领域的研究,如:动力学参数、清除率、种属间比较、酶抑制和诱导效应、药物转运载体、药物-药物相互作用等。体外肝细胞模型在毒理学领域也有广泛的应用,如:细胞毒性和基因毒性物质的筛选、化学保护剂的评价、特异性肝损伤及相关生化机制的测定等。到目前为止,体外肝细胞模型已在基础性研究和新药早期筛选中得到广泛应用。

穿山龙多糖影响NADPH氧化酶/ROS信号通路抗H_2O_2诱导的HUVECs细胞损伤作用研究

目的检测穿山龙多糖(RDNP)是否可以通过影响NADPH氧化酶/ROS信号通路对H_2O_2诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化损伤产生保护作用。方法 H_2O_2作用HUVECs 4 h造成损伤,分别给予25、50、100、200、400、800μg/m L RDNP进行干预,选取适当浓度进行后续实验。采用MTT法测定细胞活力;试剂盒检测LDH、MDA、SOD、T-AOC、GSH-Px、ROS水平;Western Bolt及qRT-PCR法检测Nox4、p22phox的蛋白及mRNA表达。结果加入50、100和200μg/m L浓度的RDNP与H_2O_2模型组间相比,活力增加,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。因此选择50、100、200μg/m L RDNP剂量组进行实验。不同浓度RDNP均可以显著改善H_2O_2损伤,使细胞形态逐渐趋于正常,以200μg/m L RDNP给药组的效果最为显著。RDNP可以降低H_2O_2损伤HUVECs模型中LDH、MDA及ROS的水平,并增强细胞内SOD、GSH-Px、T-AOC活力;且从mRNA水平及蛋白水平抑制Nox4、p22phox的表达。结论 RDNP可以通过干扰NADPH氧化酶/ROS信号通路抑制H_2O_2造成的HUVECs氧化损伤,保护内皮细胞。

促渗剂对茶多酚搽剂体外经皮渗透的影响

目的:考察促渗剂氮酮和丙二醇对茶多酚搽剂体外经皮渗透的影响,为该制剂的组方提供实验依据。方法:采用小鼠离体皮肤作为渗透屏障,以茶多酚中主要活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)为检测指标,采用HPLC测定,研究氮酮和丙二醇对茶多酚的促渗作用。结果:含2%氮酮和10%丙二醇的1%茶多酚搽剂、含2%氮酮的1%茶多酚搽剂以及含10%丙二醇的1%茶多酚搽剂24 h累积渗透量分别为不含促渗剂的1%茶多酚搽剂的5.86,5.02和1.18倍。结论:10%丙二醇对茶多酚搽剂具有一定的促渗作用,2%氮酮促渗效果显著,二者联合使用对茶多酚搽剂的促渗效果最好,其渗透动力学行为可用Higuchi方程描述。

HPLC法同时测定大鼠尿和胆汁中4种儿茶素类活性成分

目的:建立一种反相HPLC法同时测定大鼠尿和胆汁中茶多酚(TP)的4种儿茶素类活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)和表儿茶素(EC),为TP自大鼠尿和胆汁的排泄研究提供测定方法学。方法:采用RP-HPLC-UV法,使用Kromasil-C18(4.6mm×150mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.1%枸橼酸溶液为流动相,洗脱方式采用组成梯度和流速梯度,检测波长为280nm;尿或胆汁样品200μL中加入20%维生素C20μL以及10μg.mL-1香草醛内标溶液(IS)20μL,乙酸乙酯500μL液-液萃取2次,N2流挥干后加20%乙腈水溶液100μL溶解,取上清液60μL进样分析。结果:EGCG、ECG、EGC、EC和IS的保留时间分别为11.81,18.02,6.21,10.42,16.36min,各组分之间达基线分离且不受空白基质、代谢物和TP中其他成分的干扰。4种儿茶素类活性成分的尿/胆汁标准曲线的线性范围分别为0.5～10μg·mL-1/0.2～5μg·mL-1(EGCG)、0.125～5μg·mL-1/0.2～5μg·mL-1(ECG)、2.5～50μg·mL-1/0.8～20μg·mL-1(EGC)和1～20μg·mL-1/0.4～10μg·mL-1(EC)(r>0.9977)。QC样品的日内和日间精密度RSD均小于10%;准确度均在90%～110%;EGCG、ECG、EGC、EC及IS在尿和胆汁中的萃取回收率均大于60%和80%。应用上述方法测定大鼠静脉注射TP100mg·kg-1后尿和胆汁8h总累积排泄分数为1.57%(EGCG)、2.00%(ECG)、8.33%(EGC)和10.67%(EC)。结论:本文建立的RP-HPLC-UV法专属性及重现性好,准确可靠,可用于大鼠尿和汁胆中4种儿茶素类活性成分的同时测定及其体内排泄研究。

乌苏瑞宁对家兔血液流变学和血凝时间及小鼠出血和凝血时间的影响

目的研究乌苏瑞宁(verussurinine,VSRN)对家兔血液流变学和血凝时间参数及小鼠出血、凝血时间的影响,以查明乌苏瑞宁是否为乌苏里藜芦总碱的抗栓活性成分。方法应用血液流变仪测定低切和高切全血比黏度、血浆比黏度;应用血凝仪测定凝血酶时间(TT)和复钙时间(RT);应用鼠尾横切法和毛细玻璃管法分别测定出血、凝血时间。结果家兔和小鼠iv4种不同剂量的乌苏瑞宁导致家兔全血比黏度及血浆比黏度呈剂量依赖性降低;TT和RT显著延长;小鼠出血、凝血时间明显延长。结论乌苏瑞宁能够显著降低家兔血液黏度,延长家兔TT和RT以及小鼠出血、凝血时间。

HPLC法同时测定大鼠血浆中茶多酚主要活性成分EGCG和ECG

目的:建立HPLC法同时测定大鼠血浆中茶多酚(tea polyphenols,TP)主要活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)的浓度,为TP药代动力学研究提供测定方法学。方法:采用RP-HPLC法,使用Kro-masil-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,预柱为Kromasil-C18保护柱(4.6mm×20mm,10μm),以乙腈-0.1%枸橼酸溶液(14:86)为流动相,流速1.5mL.min-1,检测波长280nm;血浆样品200μL加75μg.mL-1间苯二酚内标溶液10μL,乙酸乙酯400μL提取2次,N2流挥干后加10%乙腈水溶液100μL,漩混1min,4℃低温离心(7500r.min-1)10min后,取上清液60μL进样分析。结果:EGCG和ECG的保留时间分别为9.92min和29.51min,间苯二酚的保留时间为5.96min,三者之间达到基线分离,并不受空白血浆和代谢物以及茶多酚中其他成分的干扰。EGCG和ECG标准曲线的线性范围分别为0.5～300μg.mL-1(r=0.9999)和0.1～60μg.mL-1(r=0.9999);日内精密度RSD均小于5.7%,日间精密度RSD均小于11.2%;准确度为94.78%～110.6%;EGCG、ECG和内标的萃取回收率分别为85.73%～91.93%,79.08%～86.51%,91.88%～94.88%;血浆样品在-20℃保存下至少在21d内和室温保存下8h内稳定。大鼠ivTP100mg.kg-1后血浆样品应用上述方法测定血药浓度,表明TP药动学行为遵循二室模型一级动力学。结论:本文建立的大鼠血浆中TP主要活性成分EGCG和ECG的HPLC测定方法准确,专属性及重现性好,且快速简便,可用于TP注射液的非临床药代动力学研究。

中药对细胞色素P450 2E1影响的研究进展

细胞色素P450 2E1(CYP2E1)不仅参与药物代谢,还能催化许多前毒物和前致癌物的活化过程。近年发现许多中药能抑制或诱导CYP2E1活性,从而导致有益的和不利的药物相互作用。以近年国内外文献报道以及相关研究为依据,综述了中药有效成分、提取物和单复方对CYP2E1的影响,以及CYP2E1介导的中药药物相互作用,并对其影响机制进行简要介绍。以期为中药的临床合理使用,提高其有效性和安全性提供参考。