维生素K_(3)激活黄嘌呤氧化酶的动力学和分子机制

目的考察维生素K_(3)对人肝来源的黄嘌呤氧化酶(XO)的激活作用及其作用机制。方法以人肝S9(0.1 g·L^(-1))作为XO来源,分别与底物黄嘌呤(0,2,4,8和16μmol·L^(-1))在37℃孵育90 min,液相色谱二极管阵列法测定反应的米氏常数(K_(m))。黄嘌呤在K_(m)浓度下,三点法(维生素K_(3)1,10和100μmol·L^(-1))检测维生素K_(3)激活剂的活性,多点法(维生素K_(3)1,2,5,10,20,50,100,200和400μmol·L^(-1))测定其激活XO的半数有效浓度(EC_(50))。使用1/2EC_(50),EC_(50)和2EC_(50)维生素K_(3)进行动力学参数(K_(m)和V_(max))的测定和双倒数曲线的拟合,考察不同浓度维生素K_(3)存在下的动力学行为变化,并分析其激活类型。最后,通过分子对接技术探究XO与维生素K_(3)之间的互作机制。结果XO介导黄嘌呤氧化反应的K_(m)为4.71μmol·L^(-1)。作为该反应的激活剂,维生素K_(3)浓度依赖性激活XO(logistic拟合公式y=A2+(A1-A2)/1+(x/x_(0))^p),且EC_(50)为32.0μmol·L^(-1)。反应的动力学参数在加入维生素K_(3)后发生变化,K_(m)值随维生素K_(3)浓度增加而减小(4.71~1.34μmol·L^(-1)),而V_(max)值随维生素K_(3)浓度增加而增加(0.08~1.31μmol·min^(-1)·g^(-1)),最终导致V_(max)/K_(m)增加(17.0~977.6 mL·min^(-1)·g^(-1))。此外,双倒数曲线拟合表明维生素K_(3)对XO的激活类型为混合型。分子对接结果显示,维生素K_(3)结合于XO的钼喋呤结构域,与Arg599和Ser605形成氢键相互作用。结论维生素K_(3)是XO的激活剂,可与XO结构域中的Arg599和Ser605形成氢键,调节其与底物黄嘌呤的亲和力,达到激活XO而升尿酸的效果。