端粒酶逆转录酶基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体的构建和鉴定

目的 利用端粒酶逆转录酶基因启动子 ,构建能在人肿瘤细胞中特异表达目的基因的表达载体。方法 通过PCR方法从 pEGFP N1质粒中扩增出绿色荧光蛋白基因并克隆到逆转录病毒载体pLNCX的多克隆位点上 ,命名为 pLNCX EGFP。设计含有特定酶切位点的引物 ,从人基因组中扩增出端粒酶逆转录酶基因启动子序列 ,将该序列片段定向克隆到已用限制性内切酶切除巨细胞病毒启动子的 pLNCX EGFP载体上 ,构建成端粒酶逆转录酶基因启动子调控的含有绿色荧光蛋白报告基因的表达载体 pLNT EGFP。将该表达载体pLNT EGFP瞬时转染高表达端粒酶活性的HLF细胞株和不表达端粒酶活性的WI38细胞株 ,以检测端粒酶逆转录酶基因启动子的转录活性。结果 表达载体pLNT EGFP经酶切、测序分析证实与设计的完全一致。细胞瞬时转染结果表明 ,pLNT EGFP能特异地在端粒酶阳性细胞中高效表达绿色荧光蛋白报告基因 ,而在端粒酶阴性细胞中不表达报告基因。结论 成功构建了由端粒酶逆转录酶基因启动子调控的肿瘤细胞靶向表达载体。

野生型p53基因对人胃癌细胞端粒酶逆转录酶mRNA转录的影响

目的 研究野生型 p5 3基因对人胃癌细胞端粒酶逆转录酶 (hTERT )mRNA转录及端粒酶活性的影响。方法 将含人野生型 p5 3基因的pcDNA3 p5 3转染人胃癌细胞系BGC 82 3 ,通过半定量逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测转染后细胞hTERT基因mRNA的转录 ,聚合酶链式反应结合酶联免疫吸附 (PCRELISA)方法检测端粒酶活性。结果 转染野生型 p5 3基因后 48、72hBGC 82 3细胞的hTERT基因mRNA转录量由对照组的 ( )下降为 ( )和 (+ ) ;转染前BGC 82 3细胞表达高水平的端粒酶活性 (3 .0 49) ,而转染 48、72h后的端粒酶活性分别为 1.678和0 .75 7。结论 野生型 p5 3基因能够显著抑制人胃癌细胞hTERT基因mRNA的转录 。