Pax5对B细胞分化发育调控作用的研究进展

转录因子Pax5在B细胞定向分化发育过程中发挥重要调控作用。B细胞定向分化发育相关的转录因子如PU.1、干扰素调节因子4(Interferon regulatory factor 4,IRF4)、IRF8和NF-κB结合在Pax5基因5’上游增强子区,转录因子EBF、STAT5结合在Pax5基因5’上游启动子区,从而共同促进Pax5基因的表达。表达的Pax5蛋白不仅通过IgH的V(D)J片段染色质的甲基化和乙酰化修饰来调节IgH V(D)J重排,并且通过B细胞特异性基因(mb-1、VpreB、λ5、CD19、BLNK等)表达调控B细胞的定向分化发育。若Pax5基因缺失,影响组蛋白H3-K9的修饰,导致B细胞向非B细胞分化。总之,Pax5在B细胞定向分化发育中起到重要调控作用。

血管内皮细胞黏附分子胞外区基因真核表达载体构建及表达

目的构建并表达血管内皮细胞黏附分子(VCAM-1)胞外区基因真核表达载体。方法从小鼠NIH/3T3细胞提取总RNA,以其为模板通过RT-PCR扩增VCAM-1胞外区(D1-D4结构域)cDNA。利用PCR获得VCAM-1胞外区基因,连接pMD19-T载体,进行基因序列测序。将VCAM-1 D1-D4目的片段插入到真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc中,构建重组真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1。经双酶切鉴定VCAM-1胞外区基因真核表达载体构建的成功与否。利用脂质体把pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1导入至人B淋巴性白血病细胞株(Raji)内。结果基因测序结果表明成功扩增出VCAM-1胞外区基因,双酶切鉴定表明重组的真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1构建成功。Western blot结果显示导入pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1质粒的Raji细胞中VCAM-1高表达。细胞结合实验表明,表达的VCAM-1与前B细胞(70Z/3)表面的VLA-4特异性结合。结论 VCAM-1真核表达载体构建及表达成功,为前B细胞克隆形成机理以及为B细胞分化发育研究提供实验依据。

EID3基因在大肠癌传代细胞mRNA的表达及其克隆

目的研究新的大肠癌相关性抗原EID3基因的克隆及其诊断价值。方法用SEREX技术筛选睾丸组织cDNA噬菌体表达文库,发现了一类似于肿瘤抑制基因(E1A基因)的EID3基因(NM_001008394.1),构建原核表达载体pET32k-EID3,IPTG诱导重组EID3蛋白质的表达,并利用Ni NTA His Bind树脂纯化该重组蛋白质。用RT-PCR技术研究EID3mRNA在正常组织和大肠癌传代细胞的表达。结果经PCR扩增成功获得1002bp的人EID3基因,测序正确。在大肠杆菌中目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的10%,SDS-PAGE及Western blot分析显示,其相对分子质量为39000KD,纯化后的6xHisEID3纯度可达92%。通过RT-PCR分析发现,EID3基因在43例大肠癌传代细胞株中有39例阳性,阳性率为90.7%。在正常组织中,除睾丸组织不表达或有极低水平转录外,余均不表达。结论 EID3基因克隆、表达及纯化的成功,为其今后的肿瘤诊断和肿瘤多肽疫苗治疗研究奠定了基础。EID3m RNA表达检测用于诊断大肠癌,可能具有高特异性和高敏感性的特点。EID3蛋白在大肠癌患者中能够诱导机体的抗体免疫应答,可能成为一个新的大肠癌相关性抗原分子,其用于诊断大肠癌的可行性,有待进一步深入研究。