新型蛋白标签在分子生物学中的应用

蛋白标签技术在细胞蛋白定位等基础研究中的应用已经极为日常化和普遍化。传统的融合蛋白标签在蛋白定位、转运、相互作用以及构象改变等研究中发挥重要作用。但是来自这类标签的信号不能随意开启,从而会妨碍一些蛋白表达、定位及降解的时间分辨研究。随着技术的不断进步,研究人员相继开发出了具有不同功能的新型蛋白标签。这些新型蛋白标签可为活细胞表面蛋白及细胞内蛋白成像、时间分辨标记、蛋白捕获及纯化、蛋白质定位及转运、活细胞内初期蛋白合成及复合体形成等蛋白动力学、脉冲追踪分析等方面的研究提供强有力的工具。

蓝氏贾第鞭毛虫沉默信息调节因子2重组蛋白复性方法比较

目的采用3种不同复性方法获得具有生物活性的重组蛋白蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,Gl)沉默信息调节因子2(GlSir2),并比较3种方法的复性效率,为研究其活性和生物学功能奠定基础。方法表达并纯化GlSir2的包涵体,分别采用稀释复性、透析复性和柱上复性等3种方法对GlSir2包涵体进行复性,并通过检测复性蛋白的活性,比较3种复性方法的特点。结果蛋白活性回收以柱上复性较高,为1 712Flu,透析复性和稀释复性法分别为758Flu和206Flu。结论 3种复性方法均能获得有活性的融合蛋白GlSir2,其中以柱上复性方法处理的蛋白活性回收值最高。

蓝氏贾第鞭毛虫稳定表达载体的构建

目的构建蓝氏贾第鞭毛虫基因的稳定表达载体。方法以本实验室构建的pGL gdh-Neo为基础,在gdh5′UTR端ApaⅠ酶切位点前插入蓝氏贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶(tim)基因以方便载体与贾第虫基因组整合,得到pGLtim-gdh-Neo;设计含有16个酶切位点的多克隆位点区(MCS)并将其置于α2-Tubulin启动子调控下,使成为一个完整表达框,合成该表达框并单酶切插入重组质粒pGL tim-gdh-Neo的ApaⅠ位点,获得重组稳定表达质粒载体pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo。在MCS区插入Luc验证其有效性,以pTAL-Luc质粒为模板,扩增Luc基因序列,纯化后将其插入EcoRⅤ单酶切的pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo多克隆位点区,重组质粒线性化后转染虫体,并对G418筛选获得的Luc贾第虫重组株进行荧光素酶活性检测。结果构建了可稳定转染,带有多克隆位点区及Neo抗性基因的重组表达载体pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo,其长度为5 395bp;Luc重组质粒pGL tim-Tub-Luc-gdh-Neo可稳定转染至贾第虫并表达荧光素酶。结论成功构建了蓝氏贾第鞭毛虫稳定表达载体pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo。

中国人源蓝氏贾第鞭毛虫ppdk基因的克隆及其表达产物的鉴定

目的获取中国人源性蓝氏贾第鞭毛虫ppdk基因及相关基因产物方法以中国人源性贾第虫基因组DNA为模板,设计引物进行PCR扩增,获取ppdk基因并进行测序分析。筛选得到的阳性克隆连接至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体,并转化宿主菌大肠埃希菌感受态细胞E.coliBL21(DE3),进行重组蛋白的IPTG诱导表达。收集重组表达产物进行亲和层析纯化,再用Western blot进行免疫学分析鉴定。结果序列测定分析可知,获得的阳性克隆插入片段包含一个2 655 bp的开放阅读框架;比对其基因序列发现,其与ATCC 50803(美国WB虫株C6株)的同源性可高达99%。该基因片段编码884个氨基酸,预测其表达蛋白的分子质量单位大小约为97.6 ku。Western blot显示该基因序列的原核表达产物能够被抗6个组氨酸标签的特异性抗体识别,提示重组表达产物为实验预期的目的蛋白。结论对贾第虫ppdk基因进行了克隆及原核表达,并对表达产物进行了纯化和免疫学初步鉴定,为贾第虫病治疗的高通量药物筛选等的研究奠定了基础。