人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1双顺反子表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的尝试构建人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)基因双顺反子表达载体并检测其在293T细胞中的表达情况和生物学活性,为深入探讨LOX-1在动脉粥样硬化中的作用和以LOX-1为靶点建立干预机制治疗动脉粥样硬化奠定基础。方法首先根据Primer5.0软件设计引物,采用聚合酶链反应法以LOX-1 c DNA片段为模板扩增LOX-1基因完整编码区,克隆至T载体,经测序成功后亚克隆到双顺反子真核表达载体p IRES2-Ac GFP1-Nuc。利用脂质体转染法将双顺反子重组表达质粒转染至293T细胞,倒置荧光显微镜检测质粒转染情况。采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法鉴定LOX-1基因在核酸和蛋白水平的表达,采用激光共聚焦检测LOX-1基因在293T细胞膜上的表达,激光共聚焦和流式细胞术检测表达在293T细胞膜上的LOX-1结合氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的生物学活性。结果成功构建p IRES2-LOX-1双顺反子重组表达载体,将其转染293T细胞后,观察到绿色荧光蛋白基因的表达,初步表明LOX-1基因转染至293T细胞。进一步分子水平鉴定结果表明LOX-1基因在293T细胞核酸和蛋白水平均得到表达,激光共聚焦结果证明LOX-1基因在293T细胞膜上表达。最后激光共聚焦和流式细胞术结果证实表达在293T细胞膜上的人LOX-1基因可以结合氧化型低密度脂蛋白。结论成功构建人LOX-1基因双顺反子表达载体,在此基础上证明其在293T细胞膜上得到表达,并且具有结合ox-LDL的生物学活性,为后续体外研究其在动脉粥样硬化中的作用以及以此为靶点建立干预机制奠定了基础。

1种新型脂质配体对J774A.1小鼠巨噬细胞动脉粥样硬化相关基因表达的影响

目的探讨源于oxLDL的1种新型脂质配体7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷(oxLig-1)对巨噬细胞动脉粥样硬化差异表达基因的调控。方法本实验室化学合成oxLig-1,分别以20μg/ml oxLig-1和DMSO作用J774A.1细胞2 h,随后使用Trizol reagent(Invitrogen,Calsbad,CA)提取细胞总RNA,用小鼠动脉粥样硬化RT2ProfilerTMPCR Array同时检测84个基因的mRNA水平。基因表达上调以正值表示,下调以负值表示。结果基因芯片结果显示oxLig-1处理组细胞相较于未经oxLig-1处理组正常细胞,以差异倍数大于2的基因为差异显著基因,总共有20个基因。对其中差异倍数大于4的8个基因进行着重的分析,其中上调显著的5个基因分别是:Apolipoprotein A-I(Apoa1,34.62倍),Apolipoprotein B(Apob,4.50倍),Interleukin 1 receptor type I(Il1r1,6.40倍),Interleukin 3(Il3,6.10倍),Neuropeptide Y(Npy,6.99倍)。下调显著的基因分别是:Kinase insert domain protein receptor(Kdr,6.43倍),Laminin alpha 1(Lama1,20.24倍)和Transforming growth factor-beta 1(Tgfb1,4.62倍)。这些上、下调差异显著基因分别涉及脂类代谢、血液凝固与循环、细胞黏附、应激反应与细胞外基质分子。结论 oxLig-1对巨噬细胞动脉粥样硬化基因产生了较为广泛的调控作用。

原核表达Lunasin的抗炎生物学活性鉴定及其对J774A.1细胞组织因子表达的影响

目的检测原核表达Lunasin(露那辛)的抗炎生物学活性,为Lunasin今后在生物医药领域的开发奠定基础。方法利用基因工程技术将PCR扩增得到的Lunasin DNA片段定向克隆至表达载体p ET28,酶切及测序鉴定后对其诱导表达,利用镍离子亲和层析法对其进行纯化;Griess法和ELISA法检测小鼠J774A.1细胞培养液中Lunasin对一氧化氮和肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等炎症因子含量的影响;Western blot检测Lunasin对核因子κB(NF-κB)p65磷酸化以及组织因子(TF)表达的影响。结果成功构建了Lunasin的原核表达载体,获得纯度达90%的Lunasin多肽。Lunasin能通过抑制脂多糖(LPS)诱导小鼠J774A.1细胞NF-κB的活化而抑制一氧化氮合成以及下游基因肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的表达。Lunasin对LPS诱导的J774A.1细胞TF的表达也具有显著抑制作用。结论原核表达的Lunasin表现出显著的抗炎生物学活性,明显抑制LPS诱导的J774A.1细胞TF表达,其机制可能是通过抑制NF-κB的活化而实现的。

3D培养人工皮肤组织黑色素瘤模型建立及评价

目的建立体外人工皮肤组织黑色素瘤模型,为研究黑色素肿瘤侵袭和转移的机制及药物筛选奠定基础。方法采用3D培养技术,制备体外人工皮肤组织黑色素瘤C8161、A375模型。应用不同浓度血清(0.5%、5%)优化模型的最优培养条件。HE和免疫荧光观察该模型基底膜形成情况,检测黑色素瘤细胞C8161、A375侵袭能力。应用单层细胞培养检测细胞生长速度和细胞分泌E-钙黏素情况。采用Transwell实验检测不同黑色素瘤细胞侵袭能力。结果体外人工皮肤组织肿瘤模型建立成功,血清浓度0.5%为最佳3D培养条件。构建的人工皮肤组织肿瘤模型形成的基底膜良好,黑色素瘤细胞在此模型中发生侵袭和转移,且C8161侵袭能力强于A375细胞。侵袭力较弱的A375细胞增殖速度高于侵袭力较强的C8161细胞。C8161和A375细胞均不产生E-钙黏素。结论成功建立体外人工皮肤组织肿瘤模型,血清浓度为0.5%为最佳3D培养条件;黑色素瘤细胞的侵袭与生长速度并无直接关系,且失去E-钙黏素表达能力并不是导致肿瘤细胞侵袭的必要条件。

人LOX-1基因毕赤酵母表达载体的构建与表达研究

目的构建血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)真核表达载体,筛选高表达菌株,为体外获得有活性重组蛋白奠定基础。方法以实验室保存的含有人源LOX-1基因的质粒为模板PCR扩增LOX-1基因,经过TA克隆后亚克隆至酵母表达载体p PICZαA,将获得的重组质粒电转化至毕赤酵母X-33,利用原位双膜法快速检测阳性高表达菌株,最后经过甲醇诱导,采用Western blot检测LOX-1的表达。结果成功构建LOX-1真核表达载体,双膜法筛选到高表达菌株;Western blot结果显示,LOX-1在上清中得到表达。结论 LOX-1基因在毕赤酵母细胞上清中得到表达,为体外获得活性重组蛋白和研究其致动脉粥样硬化功能奠定基础。