旋转壁式生物反应器中微囊化骨髓间充质干细胞支持造血干/祖细胞的体外扩增

为了构建一种新型的造血干细胞和基质细胞动态共培养体系,脐带血单个核细胞和包埋有兔骨髓间充质干细胞的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(alginate-chitosan-alginate,ACA)微胶囊在旋转壁式生物反应器(rotating wall vessel,RWV)中进行了7d动态悬浮共培养。培养液不含血清,补充多种生长因子(SCF50ng·mL-1,FL50ng·mL-1,TPO50ng·mL-1及IL-325ng·mL-1)。每24h进行总有核细胞计数,并测量培养液的pH和渗透压,在0h、72h和168h进行流式CD34+细胞分析以及集落形成能力检验。结果表明在RWV动态共培养过程中,培养液的pH保持在7.2~7.4,渗透压保持在280~310mmOsmol·kg-1,均适合造血干/祖细胞的体外扩增。经过7d的无血清动态共培养,总有核细胞、CD34+细胞以及混合集落(colony-formingunitsinculture,CFU-Cs)分别扩增了107.05±6.08,26.52±1.5和19.2±3.18倍。这种新型的动态微囊化共培养体系支持了造血干/祖细胞的大规模体外扩增,基质细胞抑制了造血干/祖细...

同时扩增与收获脐带血来源造血干细胞及间充质干细胞的研究

目的为利用生物反应器,实现脐带血(Umbilical cord blood,UCB)来源的造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)与间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的同时扩增与收获。方法为在不添加血清、只添加细胞因子组合(SCF15ng·mL-1,FL5ng·mL-1,TPO6ng·mL-1,IL-315ng·mL-1,G-CSF1ng·mL-1,GM-CSF5ng·mL-1)及海藻酸钙壳聚糖胶珠包被基质细胞支持的条件下,采用玻璃包被的聚苯乙烯(Glass coated styrene copolymer,GCSC)微载体与生物反应器相结合的策略,考察了UCB-HSCs与UCB-MSCs在转瓶及旋转壁式生物反应器(Rotating wall vessel bioreactor,RWVB)内的共培养。结果RWVB中的扩增效果最佳,12天内有核细胞(Nuclear cells,NCs)扩增了3.7±0.3倍;集落形成细胞(Colony-forming units in culture,CFU-Cs)扩增了5.1±1.2倍;CD34+CD45+CD105-(HSCs)细胞扩增了5.2±0.4倍;CD34-CD45-CD105+(MSCs)细胞扩增了13.9±1.2倍。培养结束后,通过自由沉降的方法分离UCB-HSCs和粘附在GCSC微载体表面的UCB-MSCs。同时,细胞多向诱导分化及免疫表型分析结果显示,粘附在GCSC微载体表面上的细胞能够向骨、软骨及脂肪细胞分化;并能够表达间质细胞相关表面标志CD13,CD44,CD73和CD105,而不表达造血细胞的相关表面标志CD34,CD45及HLA-DR,与骨髓MSCs相一致。结论为添加细胞因子、基质细胞及微载体支持的条件下,在生物反应器内能够实现UCB-HSCs和UCB-MSCs的同时扩增与收获。

神经干细胞对去血清诱导PC12细胞凋亡的作用

肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12cells)去血清后,其凋亡与多巴胺能神经元的凋亡有许多共同之处,今通过研究神经干细胞(NSCs)对去血清诱导的PC12细胞凋亡的作用,进一步为NSCs移植治疗神经系统疾病提供相应的实验和理论依据。将正常培养的PC12细胞与NSCs以不同的方式进行去血清共培养,观察PC12细胞的形态,检测PC12细胞的活性,计算PC12细胞的存活率,同时检测培养基中胶质细胞源神经营养因子(GDNF)的浓度,分析不同培养方式下NSCs对去血清诱导凋亡的PC12细胞的作用以及NSCs与去血清诱导凋亡的PC12细胞共培养后,其分泌GDNF的能力。结果表明:①去血清诱导PC12细胞凋亡呈时间依赖性,去血清72h后,PC12细胞存活的比率为44.25%;②NSCs培养基对去血清诱导凋亡的PC12细胞没有明显的保护作用;③NSCs培养上清及NSCs对去血清诱导凋亡的PC12细胞具有保护作用;④NSCs与去血清诱导凋亡的PC12细胞共培养后,分泌GDNF的能力增强。

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。目的：探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达。设计：单一样本观察。单位：大连市干细胞与组织工程研发中心，大连医科大学基础医学院生化室。材料：实验于2006—03／2007—06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成。新西兰大白耳兔，5月龄，雌雄不拘，体质量2．0～2．5kg。方法：以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定。真核表达质粒经酶切鉴定后，采用Lipofectamine2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞。并于转染后24h在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。主要观察指标：表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定。结果：实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因，并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接。经转染兔骨髓间充质干细胞24h后，在倒置荧光显微镜488am蓝光激发下观察，pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光，未经转染的细胞未见发出绿色荧光，说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞。结论：骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体在骨髓间充质干细胞中的表达

背景:骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增,还易于外源基因的转入及表达,是一种理想的治疗性细胞和基因治疗的靶细胞。目的:观察脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达。设计、时间及地点:单一样本观察的细胞基因工程实验,于2006-03/2007-04在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。材料:5月龄新西兰大白耳兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。方法:采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因片段,定向克隆至载体pMD19-T,限制性内切酶消化鉴定、基因测序后,构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。酶切鉴定后,采用Lipofectamine2000介导胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞。主要观察指标:倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。结果:成功克隆了胞嘧啶脱氨酶基因,基因测序结果同Genbank中公布的序列一致。将胞嘧啶脱氨酶基因亚克隆到pIRES2-AcGFP1质粒上,构建了pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体。利用脂质体介导法将胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞,24h后在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体已成功转入骨髓间充质干细胞中,说明骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。

冷冻保护剂导入细胞过程的模拟和优化

在细胞的低温保存中，通常需要导入冷冻保护剂来减轻冷冻过程对细胞的损伤。利用Kedem-Katchalsky模型模拟冷冻保护剂导入过程中细胞体积的变化以及胞内保护剂浓度的变化，考察导入过程对细胞的体积损伤和渗透损伤，以达到优化保护剂的导入过程的目的。结果表明：低浓度（1～2mol／L）保护剂一步导入过程的体积损伤和渗透损伤很小。因此在导入保护剂时可采用一步法；对于高浓度（6～9mol／L）的保护剂，相对于一步导入，分步导入和连续导入能显著减轻保护剂导入过程对细胞造成的体积损伤和渗透损伤。另外，分步导入以四步较好，连续导入可采用线性梯度和S型曲线梯度导入方式。

原儿茶酸调节神经干/祖细胞分化的作用研究

目的观察原儿茶酸调节体外培养的神经干/祖细胞分化及对细胞分化显型的保护作用。方法神经干/祖细胞取自胚胎14 d小鼠海马组织,以单层贴壁方式培养。免疫荧光染色标记分化的细胞,CCK-8试剂盒检测细胞的生存力,流式细胞仪分析凋亡细胞。结果原儿茶酸单独使用不能诱导神经干/祖细胞的分化,但与1%胎牛血清的联合应用时,原儿茶酸(0.06 mmol.L-1)有效地提高神经元的分化比例,介导神经元的成熟并促进突触的伸长;另一方面,原儿茶酸明显提高了分化显型的生存力并抑制了细胞凋亡,同时激活了细胞内源性的抗氧化酶系统。结论原儿茶酸能够有效地促进神经干/祖细胞分化为神经元的比例并提高细胞分化显型的生存力。

角膜内皮细胞玻璃化冷冻保护剂的实验研究

对角膜内皮细胞的玻璃化冷冻保护剂进行了研究,进而获得一种玻璃化溶液。首先筛选渗透性保护剂;在此基础上,进行糖类非渗透性保护剂的筛选。渗透性保护剂的筛选范围包括二甲基亚砜、乙二醇、1,2-丙二醇、2,3-丁二醇、乙酰胺和乙二醇单甲醚。糖类非渗透性保护剂包括木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖。所采用的细胞活性的评价方法包括台盼兰拒染法和CCK-8试剂盒。研究结果表明:在众多的渗透性保护剂中,乙二醇的保护效果最好;糖类保护剂中,葡萄糖的保护效果较好。获得的玻璃化溶液的组成是:载体溶液-乙二醇-葡萄糖,其中乙二醇和葡萄糖的浓度分别为52%(w/w)和8%(w/w)。经此玻璃化溶液冷冻保存后的角膜内皮细胞的活率高达(85.5±0.7)%。

微囊化基质细胞对脐带血造血干/祖细胞扩增支持

将脐带血单个核细胞与包埋有兔骨髓间充质干细胞的海藻酸钙微胶珠在3种不同的培养液中进行了7d的体外静态共培养.每24h进行总有核细胞计数,在0、72和168h进行流式CD34+细胞分析以及甲基纤维素集落检验.实验结果表明:经过7d的静态共培养,在添加常规剂量造血生长因子的培养液中,总有核细胞扩增了(15±2.85)倍,CD34+细胞扩增了(5.33±0.32)倍,CFU-Cs扩增了(5.6±1.21)倍.微胶囊可以作为一种新的共培养隔离手段,微囊化兔骨髓间充质干细胞在添加适量血清或者造血生长因子组合的条件下对于脐带血造血干/祖细胞在静态下的扩增有明显的促进作用.

悬浮和贴壁成骨细胞渗透压耐受极限及膜渗透性质的研究

在优化组织工程骨低温保存程序时,需要了解体外培养的种子细胞成骨细胞的渗透特性。尤其对于高浓度的玻璃化保护剂,更有必要设计合适的保护剂导入、洗脱方案来减小高浓度保护剂的渗透效应损伤及其化学毒性作用。利用显微镜图像分析法研究了用于构建组织工程骨的种子细胞——成骨细胞的渗透特性,其中包括细胞的等渗体积、细胞在高渗及低渗溶液中的平衡体积和细胞的非渗透体积以及细胞膜对水和冷冻保护剂的渗透系数,并比较了悬浮和贴壁的成骨细胞对渗透压的耐受范围。结果表明,在等渗条件下(289 mmol·kg-1),成骨细胞的平均体积为2585.22μm3;细胞体积随溶液渗透压的变化规律符合理想渗透压变化曲线,即Boyle van’t Hoff关系式,由该关系式得到成骨细胞的渗透体积为0.335 V0;室温下,在2 mol·L-1二甲基亚砜(DMSO)和1,2-丙二醇(PD)中成骨细胞膜对水的水力传导系数分别为1.5×10-13和5×10-13 m3.N-1·s-1,对保护剂的渗透系数分别为7.5×10-11和120×10-11mol·N-1·s-1;贴壁的成骨细胞对渗透压的耐受范围远低于悬浮细胞,说明了贴壁细胞与悬浮细胞渗透特性的差异。由以上参数结合相关数学模型能够设计和研究冷冻保护剂的导入、洗脱方案,以使组织工程骨的低温保存获得更好的效果。

壳聚糖-胶原基可注射水凝胶制备及生物相容性检测

制备了可注射的新型温敏性壳聚糖-甘油磷酸钠-胶原（chitosan-glycerophosphate-collagen，C-GP-Co）水凝胶并检测了其与脂肪间充质干细胞（adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）的生物相容性．首先将体积分数2．2％的壳聚糖溶液与质量分数50％的B．甘油磷酸钠溶液按一定比例混合后，将2mg／mL胶原溶液加入上述溶液中混合得到壳聚糖-甘油磷酸钠-胶原水凝胶；随后用扫描电镜观察其微观结构，测定了37℃时的成胶时间并测量水凝胶中提取培养基的渗透压；最后将分离、培养和免疫表型鉴定后的ADSCs接种在C-GP—Co水凝胶中培养，倒置显微镜下观察细胞的生长形态，并用Live／Dead Viability-Cytotoxieity试剂盒染色观察细胞凋亡状况，CCK-8试剂盒测定细胞增殖情况．结果表明C—GP—Co水凝胶37℃的成胶时间为12min，水凝胶内部呈海绵状多孔结构，水凝胶中提取培养基的渗透压为310-330mmol／kg．培养7d后，C-GP-Co水凝胶表面的ADSCs贴壁生长，并显示出良好的细胞活性．上述结果表明制备的C-GP-Co水凝胶具有良好的细胞相容性，可作为ADSCs生长增殖的良好支架．

基于壳聚糖/黄原胶互穿网络的导电水凝胶支架制备及性能研究

导电支架应用于神经组织工程,有利于细胞增殖生长,但支架内部的导电聚合物通常会带来细胞毒性以及疏水基团引起的细胞粘附问题。本研究通过黄原胶(XG)与壳聚糖(CS)相结合,引入透明质酸掺杂的聚3,4-乙撑二氧噻吩(PEDOT-HA)导电纳米颗粒,成功制备了一种生物相容性良好的新型PEDOT-HA/CS/XG互穿网络导电水凝胶支架。实验采用葡萄糖酸内酯(GDL)溶解CS,实现CS与XG的结合,通过优化GDL含量缩短成胶时间。引入PEDOT-HA导电纳米颗粒赋予支架材料导电性,测定PEDOT-HA含量对支架材料孔隙率、电导率、吸水率的影响,考察支架的降解性、流变性、热稳定性与力学性能。结果显示,PEDOT-HA的引入提高了水凝胶的孔隙率、电导率、弹性和机械强度,PEDOT-HA/CS/XG导电水凝胶支架吸水率为2575%~3866%,同时具有适宜的降解性与热稳定性。细胞粘附率检测及扫描电镜(SEM)观察结果表明,PEDOT-HA的引入有利于PC12细胞的粘附生长,并形成交错网状结构。细胞活力检测与荧光染色结果显示,PC12细胞在导电水凝胶支架上保持了良好的增殖活性,培养5 d后,10%PEDOT-HA/CS/XG支架上的细胞活力最高可达到对照组的120.42%,证明PEDOT-HA/CS/XG导电水凝胶支架具有良好的生物相容性,展现出应用于神经组织工程的潜力。

聚N-异丙基丙烯酰胺细胞培养平台的研究进展

聚N-异丙基丙烯酰胺(poly(N-isopropylacrylamide),PNIPAAm),温敏性聚合物,可利用其温敏特性替代酶类物质或细胞刮刀用于贴壁细胞的收获,从而有效避免酶解和机械损伤,可为生物医药领域提供品质优良的种子细胞。重点阐述促进细胞有效粘附和快速脱附的温敏性PNIPAAm二维平面的研发情况,包括选取特殊基材、引入亲水基团、调节反应物比率、控制聚合物厚度/密度、提供适宜外力等方式,从而有效改善细胞对温敏性平面的适应性并降低染菌风险以及减少低温处理对细胞的影响。同时介绍PNIPAAm微载体、支架和凝胶等温敏性三维培养介质的研究进展,此方式不仅增加细胞生长面积,更可以模拟体内微环境,从而保持细胞原始生理特征,同时实现大规模扩增和非酶解收获细胞以及组织器官修复和重构的目标。最后简单说明PNIPAAm培养平台的应用,PNIPAAm的研发为再生医学的发展提供了崭新思路。