泥鳅鳍细胞系的构建及特性分析

采用组织块培养法对泥鳅Misgurnus anguillicaudatus鳍组织细胞进行原代培养,并采用胰蛋白酶消化法传代,目前已传63代。原代培养和早期传代培养所用培养基为DMEM/F12,并添加体积分数为20%的胎牛血清(FBS)、10 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20 ng/mLⅠ型胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)和10μg/mL硫酸软骨素。30代以后所用培养基为20%FBS-DMEM/F12,在CO2培养箱(5%,25℃)中培养,培养的鳍细胞形态为成纤维细胞样,群体倍增时间为56.85 h,特征染色体数目为50条;细胞经液氮冷冻保存30 d,解冻复苏后,存活率为81.31%±1.46%。病毒敏感性试验结果表明,泥鳅鳍细胞系对鲤春病毒血症病毒(SVCV)敏感,病毒滴度为105.62TCID50/mL,而对鱼类诺达病毒(YGNNV)不敏感。泥鳅鳍细胞系的建立丰富了鱼类细胞系的种类,并为泥鳅毒理学、病毒学的研究提供了科学依据。

迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统基因的克隆及多重PCR检测方法的建立

采用PCR法扩增大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tardaL-49231菌株Ⅲ型分泌系统(TTSS)的装置蛋白(esaC)、效应蛋白(eseB、eseC、eseD)和调节蛋白(esrA、esrB)6种基因,并将其克隆到载体PMD19-T中分别进行测序;通过优化反应条件,建立一次检出效应蛋白eseB、eseC和eseD 3种基因片段的多重PCR方法;采用所建立的多重PCR方法检测迟钝爱德华氏菌不同菌株(L-49231、GhAn080310、GhAn080313和GhAn080314)、沙门氏菌Salmonella enterica、大肠杆菌Escherichia coli和肠杆菌Enterobacter中效应蛋白基因的存在情况。结果表明:L-49231菌株中存在esaC、eseB、eseC、eseD、esrA和esrB 6种基因片段,大小分别为837、184、934、445、464、458 bp,与GenBank中迟钝爱德华氏菌PPD130/91菌株的这6种基因的同源性分别为99%、97%、99%、99%、99%、98%;通过优化反应条件,在退火温度为54℃,基因eseB、eseC和eseD引物浓度(μmol/L)组合比为5∶10∶2,Mg2+浓度为1.5 mmol/L时,能够得到清晰、稳定且均一的多重PCR产物,并与目的条带分子量一致;采用所建立的多重PCR方法进行检测,迟钝爱德华氏菌L-49231菌株中存在eseB、eseC和eseD 3种基因片段,迟钝爱德华氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314菌株中存在eseB和eseC基因片段,但未检出eseD基因片段;沙门氏菌、大肠杆菌和肠杆菌中均未检出eseB、eseC和eseD基因。表明所建立的多重PCR方法对迟钝爱德华氏菌具有较好的特异性,可检出具有Ⅲ型分泌系统效应蛋白的菌株。

松江鲈脾组织细胞的短期培养及染色体分析

采用组织块法对体质量为120~140 g的松江鲈Trachidermus fasciatus脾组织细胞进行短期培养并对染色体进行了分析。结果表明：在p H为7.2、温度为25℃的条件下,松江鲈脾组织细胞在含有20%南美胎牛血清（FBS）、人碱性成纤维样细胞生长因子（b FGF）、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样生长因子（IGF-Ⅰ）的培养基中,生长良好,迁出细胞有悬浮和贴壁两种形式;悬浮细胞为圆形和椭圆形,贴壁细胞呈变形细胞样和成纤维细胞样;利用悬浮细胞进行的染色体分析显示,松江鲈的染色体数2n=40,核型公式为14m＋10sm＋16t。本研究结果为松江鲈脾组织细胞系的构建奠定了基础,并初步建立了利用短期培养的脾组织细胞制备染色体的方法。