牛种布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株生物学特性及其免疫原性研究

布鲁氏菌四型分泌系统(T4SS)效应物BtpA是布鲁氏菌的重要免疫抑制分子之一。为了进一步了解BtpA对牛种布鲁氏菌生物学特性的影响,并探究BtpA基因缺失是否会影响布鲁氏菌的免疫原性。在牛种布鲁氏菌疫苗株(A19株)上对BtpA基因进行了缺失,通过qRT-PCR检测布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株中的BtpA mRNA表达水平,并探究布鲁氏菌A19株和A19ΔBtpA缺失株在生长曲线、胞内生存、黏附侵袭和体外应激方面的差异。此外,将A19株和A19ΔBtpA缺失株免疫小鼠,在免疫后的第7、14、21、28和35天使用间接ELISA检测小鼠体内的布鲁氏菌特异性抗体水平;通过ELISpot检测免疫第21天时小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的表达水平,利用流式细胞术测定了小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞的分类情况。结果表明:成功构建了A19ΔBtpA缺失株,A19ΔBtpA缺失株中BtpA的转录水平显著低于A19株,A19ΔBtpA缺失株与亲本株在生长曲线、胞内生存和黏附侵袭方面呈现相似的趋势。而体外应激试验显示,高渗应激条件下A19ΔBtpA缺失株的存活菌量明显低于A19株(P<0.05)。免疫原性研究中,与PBS组相比,A19组和A19ΔBtpA组均可极显著诱导小鼠产生布鲁氏菌特异性抗体(P<0.01);与A19组相比,A19ΔBtpA组淋巴细胞IFN-γ表达水平显著升高(P<0.05),使小鼠产生的IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)/CD8^(+)T细胞比值显著增高(P<0.05)。BtpA基因缺失不会影响布鲁氏菌A19体外胞内增殖,但可能参与布鲁氏菌抗高渗环境能力相关。此外,A19ΔBtpA缺失株比A19株更好地诱导Th1型免疫应答,诱导宿主产生与A19株相当的IgG特异性抗体,具有布鲁氏菌基因缺失疫苗的潜力。该研究将为进一步探究布鲁氏菌的致病机制和开发基因缺失株疫苗提供理论基础和数据支持。

牛布鲁氏菌VirB12蛋白的抗原表位生物信息学分析与原核表达

为了获得高纯度牛布鲁氏菌VirB12蛋白及其抗原表位蛋白VB-BW,试验采用生物信息学方法对牛布鲁氏菌VirB12蛋白的理化性质、空间结构、信号肽、结构域、跨膜结构、磷酸化位点、抗原表位等进行预测,在此基础上设计抗原表位蛋白VB-BW;VirB12与VB-BW基因经PCR扩增后与pGEX4T-1载体连接,并转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达蛋白;经His-Trap HP亲和纯化后对VirB12与VB-BW蛋白进行SDS-PAGE分析与Western-blot鉴定。结果表明:VirB12蛋白由172个氨基酸组成,理论等电点为10.28,脂肪族氨基酸占比较高,半衰期大于10 h;α-螺旋、β-转角、β-折叠与无规则卷曲结构占总蛋白的比例分别为38.95%、4.07%、13.95%与43.02%;含有15个氨基酸组成LIPO型信号肽与一个OmpA同源区域;无跨膜结构;有13个磷酸化位点;含有7个优势B淋巴细胞抗原表位与4个优势T淋巴细胞抗原表位;设计出的抗原表位蛋白VB-BW共有79个氨基酸,由VirB12蛋白的第67~97位与第130~172位氨基酸经刚性连接子连接组成。扩增出的VirB12与VB-BW基因大小为561 bp与270 bp;重组表达载体BL21-VB和BL21-BW在诱导剂IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导时间为10小时时表达出的VirB12与VB-BW蛋白含量最高,经纯化后最终获得大小为47.7 ku与36.3 ku的VirB12与VB-BW蛋白。说明试验构建出表达VirB12与VB-BW蛋白的原核表达体系。

牛源溶血性曼氏杆菌新疆株的分离鉴定和生物学特性

为探究新疆维吾尔自治区北疆3个奶牛养殖场和2个肉牛养殖场中犊牛死亡的原因,本试验采集有肺炎症状死亡牛的肺脏和有呼吸道症状牛的鼻拭子样品,进行细菌分离培养、生化鉴定、血清型和毒力基因PCR检测、药敏特性分析和小鼠毒力测定。结果显示:从20份样品中分离到4株溶血性曼氏杆菌,血清型A1型1株、A6型3株;4株分离菌株均能扩增出lktC、plpE、gs60、gcp和tbpB五种毒力基因;4株分离菌株均对恩诺沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、新霉素、青霉素和庆大霉素耐药,对四环素、头孢拉啶和头孢唑啉敏感。4株分离菌株对小鼠的半数致死量由低到高分别为TK-TC1株=2.7×10^(7)CFU/mL、TK-YL3株=8.5×10^(7)CFU/mL、TK-YL4株=5.4×10^(8)CFU/mL和TK-YL7株=2.1×10^(9)CFU/mL,其中TK-TC1株毒力最强。本试验可为牛场由溶血性曼氏杆菌引起的呼吸道疾病的治疗提供参考。

浅谈兽用疫苗研制和生产的生物安全管理

兽用疫苗是一种特殊产品,对动物和人类的健康与安全有直接或间接的影响,是畜牧业健康发展的基础,其生物安全管理不容忽视。本文回顾了国内兽用疫苗领域的重大生物安全事件,综述兽用疫苗研发、生产过程中存在的生物安全管理问题和国家颁布的管理政策,讨论、分析了兽用疫苗制造企业在生物安全管理方面应尽的责任与发展方向。

牛支原体兔体攻毒模型的建立

牛支原体是引起牛呼吸疾病综合征(bovine respiratory disease, BRD)的重要病原之一,对养牛业造成了不可估量的经济损失。牛支原体对大多数抗生素都具有耐药性,目前没有较好的药物可以进行治疗,因此疫苗免疫是最有效的防控方法。缺乏小动物评价模型是牛支原体疫苗研发的重要制约因素之一。建立小动物攻毒模型,为后续疫苗的研究与制备提供一定的研究基础,并降低后续试验的科研成本。为建立牛支原体小动物感染模型,本研究以2月龄日本大耳白兔作为研究对象,分为4组:1)单独攻击HB0801株牛支原体,2)注射地塞米松后攻击HB0801株牛支原体,3)攻击HB0801株牛支原体后注射KLH和巯基乙酸盐培养基;4)空白对照组。通过PCR检测牛支原体排菌情况,检测血清中抗体水平,第31天后取肺制作病理切片。研究结果显示,注射地塞米松后攻击HB0801株牛支原体组的牛支原体检出率和抗体均最高,牛支原体检出率为42.11%,91.67%的动物被检测为抗体阳性。显著高于其它各组。除空白对照组外,其它攻毒组均出现了肺泡壁增厚,巨噬细胞浸润以及肺部不同程度的纤维素性渗出,符合牛支原体导致的间质性肺炎的病变特征。本研究建立了牛支原体HB0801株攻毒日本大耳白兔的感染及评价模型,地塞米松造成免疫抑制后攻毒HB0801株具有最好的造模效果。

布鲁氏菌A19株菌影疫苗的构建及其免疫效果评价

为开发一种安全有效的布鲁氏菌疫苗,解决现有A19、S2和M5等弱毒疫苗存在较强毒力可感染人,且无法通过血清学方法将其免疫抗体与野毒感染抗体进行鉴别区分的问题,本试验将含有噬菌体PhiX174裂解酶基因E的质粒转化至A19疫苗株,构建菌影疫苗(A19-BG)菌株,并检验其遗传稳定性及对小鼠的安全性、免疫效果和保护效果。结果显示,构建成功的A19-BG菌株传代20代仍稳定,热诱导48 h后可完全灭活,菌体穿孔明显。A19-BG疫苗免疫小鼠7 d后免疫部位无不良反应,14 d后脾脏无可见病理变化,与空白对照组相比脾脏重量无显著差异(P>0.05)。一免和二免后14 d,免疫小鼠的布鲁氏菌抗体、白细胞介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平持续升高,产生了良好的体液和细胞免疫反应。布鲁氏菌2308强毒株攻毒免疫小鼠,免疫保护率可达87.5%,保护效果良好。结果表明,构建的A19-BG疫苗具有良好的稳定性、安全性、免疫效果和保护效果,有望成为一种极具潜力的布鲁氏菌新型疫苗。

六种布鲁菌病疫苗对绵羊与山羊免疫效果的比较

为了比较不同布鲁菌病疫苗对乌拉特草原以放牧为主的山羊与绵羊的免疫效果,我们在乌拉特草原6个苏木/镇,随机选取80~100日龄并经过布鲁菌病检测阴性的乌拉特土种绵羊羔385只、二狼山绒山羊羔275只,用6种布鲁菌病疫苗进行免疫效果比对试验。采用琥红平板凝集试验(RBPT)和试管凝集试验(SAT)分别对试验组羊接种疫苗后7、14、21、35、60、120、150、180、210、240、270 d进行转阳率和抗体效价检测;免疫后270 d进行攻毒试验。RBPT和SAT结果显示,M5-90Δ26和S2接种绵羊与山羊后抗体产生快,持续时间长;免疫后攻毒试验结果显示,A19点眼绵羊和A19-ΔVirB12株皮下注射绵羊保护比例均为4/6;M5-90Δ26绵羊皮下注射和ReV.1山羊点眼的保护比例均为4/5;本试验为乌拉特草原建立牛羊免疫无布鲁菌病区筛选理想疫苗,以及为创建全国首个牛羊免疫无布鲁菌病区制定合理的免疫程序提供了科学依据,同时对布鲁菌病疫苗的研制及国内其他地区布鲁菌病防治具有参考价值和指导作用。

新生仔猪饲养方法对比试验

新生仔猪是指母猪在临产前采用剖宫产手术、人工无菌接产、母猪自然分娩的方式获取仔猪,本次试验筛选3头妊娠95 d的阴性母猪,将妊娠母猪在产房饲养至预产期,分别用剖宫产手术取胎、人工无菌接产、母猪自然分娩的方式获得仔猪;然后用无菌保温转运箱把仔猪转入隔离舍饲养,本次试验将31头仔猪设为3组,第1组妊娠母猪为剖宫产获取仔猪,第2组妊娠母猪为无菌接产获取仔猪;第3组妊娠母猪为自然分娩获取仔猪,将第1、2组仔猪人工培育至14日龄断奶,第3组仔猪由母猪喂养至14日龄,统计所有仔猪健活体重,并进行分析,试验结果显示,无菌接产组获得仔猪比剖宫产取胎组、自然分娩组体重增长快、断奶死亡率低;结果表明无菌接产组仔猪采食量高于剖宫产取胎仔猪,断奶后无菌接产组成活率>母猪自然分娩组>剖宫产手术取胎组,新生仔猪的饲养管理,可以有效防止传染病的传播,也可以减少仔猪疾病的发生,提高仔猪的成活率、增加体重、降低饲料消耗率,缩短断奶时间,降低试验成本。

口蹄疫血清抗体阴性实验牛筛选方法的探讨

牛口蹄疫疫苗属于国家强制免疫疫苗,牛口蹄疫产品的动物检验是反映该批次产品是否安全有效的重要评判依据。口蹄疫阴性实验牛筛选的速度决定着该批次产品是否能快速投入市场。本实验使用口蹄疫抗体胶体金检测技术对实验牛进行阴阳性初筛,然后用口蹄疫抗体液相阻断ELSIA技术对阴性动物进行复核确认,可以实现快速筛选抗体阴性实验牛,完成口蹄疫疫苗动物实验评估。

新疆某种猪场猪瘟、猪伪狂犬病的净化与维持

猪伪狂犬病病毒(PRV)g E基因缺失疫苗的推广使用,与之配套的商品化的g E抗体ELISA检测试剂盒可以准确区分疫苗免疫和野毒感染,成为当前有效控制和净化猪伪狂犬病的主要策略。欧美许多国家根据该策略根除了PRV野毒,我国部分种猪场也因此实现了PRV的净化。

影响奶牛发情揭发率和受胎率的因素及改进措施

发情揭发作为牧场繁育工作中的基础,也是繁育工作者的必备技能,其揭发率的高低决定牧场受胎率和繁育率的水平。本文对影响繁殖受胎率和发情揭发率的主要因素展开阐述,最后提出提高牧场繁殖受胎率和发情揭发率的关键技术和管理措施。

兽用B超在规模化奶牛场繁殖上的应用

B-型超声波影像诊断技术是20世纪70年代出现的一项新技术,是继直肠触诊和血液激素放射免疫测定以来在奶牛生殖领域研究最有深远意义的技术进展,为在活体状态下研究动物的生殖和生理机能提供了便利。近几年B超在奶牛繁殖领域,如配种后的早期妊娠诊断以及性别鉴定、监测产后子宫复旧、诊断卵巢疾病、监测胎儿发育等方面得到了广泛的应用。本文将从早期妊娠诊断、性别鉴定、胎儿发育监测、卵巢疾病诊断和子宫疾病诊断5个方面的应用展开论述。

保育猪身体苍白的原因及防治措施

苍白是贫血的表现,临床上可观察到猪体表无血色,呈现灰白色,同时缺乏活力。在保育猪饲养过程中,我们时常会发现部分保育猪出现苍白的现象,苍白是由多种原因造成的,常见于缺铁、饲料因素、传染性疾病、寄生虫。对于错综复杂的疾病因素,我们想要解决猪体苍白的问题,就需要知晓具体的发病原因。

不同厂家猪肺炎支原体灭活疫苗免疫效力对比实验

本研究旨在评价不同厂家猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫攻毒保护效果。选择4周龄仔猪25头,随机分为5组,每组5头猪,分别免疫四种猪肺炎支原体灭活疫苗(即疫苗A组、疫苗B组、疫苗C组、疫苗D组),E组为攻毒对照组,不做任何处理,在同等条件下隔离饲养。各疫苗按照对应的说明书进行免疫,免疫后第14、28天进行采血,检测支原体抗体水平,一免后28 d时,所有免疫组连同攻毒对照组,各气管注射猪肺炎支原体CJ株5 m L/头(含0.01 g肺组织毒)。攻毒后饲养观察28 d,对所有实验组动物进行观察临床症状。A组实验动物攻毒后未出现咳嗽、腹式呼吸等支原体临床症状,B-D组实验猪攻毒后偶尔出现轻微间隔性咳嗽,E组实验动物攻毒后出现连续性咳嗽,个别猪出现腹式呼吸等临床症状。攻毒后第28天进行病理剖检。结果表明,攻毒对照组猪4/5头出现典型猪肺炎支原体病变,在肺脏尖叶、心叶、膈叶前1/3部位以及中间叶,出现“肉样”或“胰样”实质样病变,界限明显。B~D组解剖后个别猪出现典型猪肺炎支原体病变,A组实验动物解剖后个别猪肺脏出现零星病变,剩余实验动物肺脏均未出现猪肺炎支原体病变。根据肺部病变较少率计算,A~D组病变率分别为71.4%、42.8%、60.7%、44.6%。实验表明,4种猪肺炎支原体灭活疫苗均具有保护效果,但A组灭活疫苗与其他免疫组相比较,免疫效果明显优于其他免疫组,在猪群免疫中能够起到更好的免疫效果。

动物疫苗佐剂全球及中国专利分析

非洲猪瘟后,随着下游大型养殖企业复产和扩产,我国畜牧业得到了大力发展。进一步保障畜牧业持续健康发展、合理控制动物疫情、确保动物食品的安全性,是动物疫苗行业长期稳定增长的坚实基础。伴随着动物疫苗行业规模的不断扩大,越来越多的企业和科研机构意识到我国动物疫苗佐剂依赖技术的发展,这不利于动物疫苗行业长期发展和成本控制,应该将更多的研发资源投入到疫苗佐剂研究和开发中。本文通过专利检索和分析,对动物疫苗佐剂专利的申请、分布趋势、技术构成、专利权人、发明人构成等方面进行分析,挖掘动物疫苗佐剂领域的研究现状、趋势、主要研究单位和人才分布情况。

猪常见病毒空气传播机制、特点及防控策略

控制病毒的气溶胶传播是猪场生物安全防控体系中相对薄弱的环节,非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等都可以通过空气传播,严重威胁猪只健康和公共卫生安全,因此,深入了解这些病毒的空气传播机制和特点,并制定有效的生物安全防控措施,对防止疫情传播、降低猪场内外疾病传播风险至关重要。

两种商品化圆支二联疫苗的临床应用效果分析

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)已被确定为对全球养猪业最具经济破坏性的疾病之一。PCV2可导致仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪皮炎和肾炎综合征(PDNS)、生殖衰竭和腹泻。猪肺炎支原体(Mycoplasma Hyopneumoniae,MHP)在猪群中很常见,具有高度传染性。猪支原体肺炎由MHP引起,其特征是持续性、无痰性咳嗽,发病率高,死亡率低。会降低日均体重增加并延迟上市日龄,导致全球养猪业遭受严重的经济损失。

生物技术加工畜禽骨血转化为功能保健食品

骨宝是一种新兴生物营养制剂。它以动物骨、构杞、山药、大枣为主要原料,通过生物酶消化与超微粒化相结合的技术和现代制剂工艺精制而成。产品的主要活性营养成分是氨基酸络合钙、多肽、粘多糖,还富含铁、锌、硒及多种维生素等活性营养素。具有营养全面、溶解性好、易吸收、安全无副作用等特点。实验证明:产品具有营养补充、补钙生血、增加骨密度、预防改善骨质疏松、提高免疫力、促进生发育的营养保健作用。

气肿疽梭菌CctA全长基因的克隆及生物信息学分析

为了解气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)细胞毒素CctA的生物学功能,参照GenBank中ATCC 10092株序列设计特异性引物,试验采用PCR技术扩增获得CctA基因。通过生物信息学分析软件DNAStar、EXPASY、Signal P、NetPhos Server V.3.1等程序,对CctA基因进行序列分析,并对其编码蛋白质的结构和功能进行预测。结果表明:CctA基因编码317个氨基酸;CctA基因编码蛋白质是一种偏酸性、稳定、亲水性蛋白,无跨膜区域,但存在信号肽,含有4个N-糖基化位点,1个O-糖基化位点,以及多个磷酸化位点,其中二级结构为混合型,无规卷曲最多,有22个优势的B细胞抗原表位。说明CctA基因是气肿疽梭菌的重要毒力因子,为预防黑腿病疫苗的候选抗原,本试验成功克隆CctA基因,并分析了其编码蛋白的特性,为进一步研究气肿疽梭菌CctA基因功能及其重组蛋白提供参考。

非洲猪瘟威胁下中小型养猪场如何做好生物安全措施

中小散户大部分疫病防控意识淡薄,猪场硬件设施不完备及技术支撑匮乏,再加上猪场几乎没有生物安全防控意识,疫情暴发和传播风险很大。而非洲猪瘟的防控上仍无有效疫苗,只能依靠生物安全措施做好隔离和提升猪群整体健康度等措施。因此,在非洲猪瘟有效疫苗研发投入使用之前,为能帮助广大的中小型养猪场降低猪场感染非洲猪瘟的风险,本文根据我国非洲猪瘟疫情的发生情况,梳理了一些基本的防控策略,供广大的中小型养猪场参考。