气肿疽梭菌CctA全长基因的克隆及生物信息学分析

为了解气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)细胞毒素CctA的生物学功能,参照GenBank中ATCC 10092株序列设计特异性引物,试验采用PCR技术扩增获得CctA基因。通过生物信息学分析软件DNAStar、EXPASY、Signal P、NetPhos Server V.3.1等程序,对CctA基因进行序列分析,并对其编码蛋白质的结构和功能进行预测。结果表明:CctA基因编码317个氨基酸;CctA基因编码蛋白质是一种偏酸性、稳定、亲水性蛋白,无跨膜区域,但存在信号肽,含有4个N-糖基化位点,1个O-糖基化位点,以及多个磷酸化位点,其中二级结构为混合型,无规卷曲最多,有22个优势的B细胞抗原表位。说明CctA基因是气肿疽梭菌的重要毒力因子,为预防黑腿病疫苗的候选抗原,本试验成功克隆CctA基因,并分析了其编码蛋白的特性,为进一步研究气肿疽梭菌CctA基因功能及其重组蛋白提供参考。

非洲猪瘟威胁下中小型养猪场如何做好生物安全措施

中小散户大部分疫病防控意识淡薄,猪场硬件设施不完备及技术支撑匮乏,再加上猪场几乎没有生物安全防控意识,疫情暴发和传播风险很大。而非洲猪瘟的防控上仍无有效疫苗,只能依靠生物安全措施做好隔离和提升猪群整体健康度等措施。因此,在非洲猪瘟有效疫苗研发投入使用之前,为能帮助广大的中小型养猪场降低猪场感染非洲猪瘟的风险,本文根据我国非洲猪瘟疫情的发生情况,梳理了一些基本的防控策略,供广大的中小型养猪场参考。

栽培一枝蒿粗多糖混合口蹄疫疫苗乳化方法及稳定性分析

旨在探究栽培一枝蒿粗多糖(cultivated Artemisia rupestris L.crude polysaccharides,CARCP)协同ISA-206油乳剂通过比较不同乳化方法与口蹄疫灭活抗原(inactivated foot-and-mouth disease viral antigen,FMD-Ag)制备FMD疫苗的效果异同,并观察不同储存条件对FMD疫苗稳定性的影响。通过搅拌和超声乳化分别制备不同疫苗组合,皮下免疫ICR小鼠后检测FMD特异性抗体及T细胞亚群比例。将搅拌乳化的不同疫苗组合在4、25℃条件下放置30、180 d后免疫ICR小鼠,检测体液和细胞免疫水平分析其稳定性。结果显示:与商品化FMD疫苗相比,搅拌和超声乳化制备的CARCP单独或协同ISA-206油乳剂的FMD疫苗组的特异性IgG水平和CD3^(+)CD4^(+)、CD3^(+)CD8^(+)T细胞比例无显著性影响(P>0.05)。4℃放置30、180 d后,与商品化FMD疫苗相比,CARCP单独或协同ISA-206油乳剂的FMD疫苗组的IgG水平和CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)CD44^(+)、CD8^(+)CD44^(+)T细胞比例无显著性差异(P>0.05)。25℃放置30、180 d后,与商品化FMD疫苗相比,免疫动物后FMD-Ag+ISA-206抗体水平及T细胞亚群比例显著降低(P<0.05),而FMD-Ag+ISA-206+CARCP抗体水平及T细胞亚群比例无显著性差异(P>0.05)。搅拌和超声乳化制备的不同FMD疫苗组合的抗体水平和T细胞水平的免疫效果没有差异;不同储存条件下,CARCP能够增强FMD疫苗的稳定性,这些研究结果为CARCP多糖佐剂的研究提供试验依据。

两种不同猪瘟疫苗对育肥猪的免疫效果比较

为比较猪瘟疫苗E2基因工程亚单位疫苗和猪瘟活疫苗对育肥猪免疫效果和生产成绩的影响,以便为规模猪场在选择猪瘟疫苗时提供参考。本试验从汉中某代养场选取了一批健康的断奶仔猪分成三组,A组免疫猪瘟E2基因工程亚单位疫苗(简称E2亚单位疫苗),B组免疫猪瘟活疫苗(脾淋源),C组为对照组不做猪瘟疫苗免疫。免疫60d后各组随机抽取10、15和12份血样用猪瘟病毒抗体检测试剂盒检测猪瘟抗体水平。结果表明接种的两种猪瘟疫苗对育肥猪的免疫效果差异极显著(P<0.01),其中E2亚单位疫苗相比于猪瘟活疫苗能够明显提高育肥猪抗体阻断率和降低离散度,并且有助于育肥猪的健康生长。

布鲁氏菌病温敏凝胶活疫苗(S2株)对羊不同黏膜途径免疫效果的研究

为了研究布鲁氏菌病温敏凝胶疫苗对羊不同黏膜途径免疫的效果,本研究采用冷溶法制备了用于黏膜免疫的布鲁氏菌病温敏凝胶活疫苗(S2株),将该疫苗以不同黏膜免疫途径(阴道灌注、点眼)、注射免疫途径免疫绵羊,同时以常规S2疫苗作为对照,无菌采集绵羊的免疫部位拭子后培养,通过菌落计数方法计算黏膜免疫部位排菌数,结果显示:凝胶疫苗免疫部位从免疫后第30 min开始停止排菌,常规疫苗的排菌持续到免疫后第2 d。免疫后采集各时间点绵羊血血清,采用微量试管凝集试验(MSAT)和攻菌保护试验分别测定不同免疫途径(阴道灌注、点眼、注射)免疫后产生的抗体水平和保护效果的差异,抗体检测结果显示,黏膜免疫后45 d左右抗体即降至1.50或以下,黏膜免疫后产生的抗体水平明显低于注射免疫产生的抗体,且两种黏膜免疫下降速度均比注射免疫的快;攻菌后的免疫保护结果显示,在对照组出菌指数为4.76情况下,免疫组的单位保护(对照出菌指数-免疫出菌指数)分别达到2.19、2.42、2.78,表明3种免疫方式均具有良好的免疫保护效果,其中阴道灌注的单位保护高于点眼,与注射免疫组更接近。以上结果表明:与常规疫苗相比,温敏凝胶疫苗可有效提升疫苗的安全性。相比点眼免疫,阴道灌注的免疫保护效果更好、安全性更好,虽然点眼抗体反应更弱、持续时间更短,但与阴道灌注相比,对诊断的干扰差异不大。综合以上结果表明,两种黏膜免疫方式中,阴道灌注是较理想的黏膜免疫方式,但黏膜免疫抗体持续时间短于注射免疫。因此,采用布鲁氏菌病温敏凝胶疫苗进行黏膜免疫更有利于鉴别诊断,同时也为新型布鲁氏菌病疫苗的研究提供新的思路。

单增李斯特菌srtA基因缺失株的构建及srtA基因对其毒力的影响研究

为了研究srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2毒力的影响,本研究利用同源重组技术构建了LM90SB2 srtA 基因缺失株LM90SB2-ΔsrtA,比较分析了亲本株LM90SB2与缺失株LM90SB2-ΔsrtA对MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC 4种细胞系的粘附、侵袭、胞内增值能力及LM90SB2和LM90SB2-ΔsrtA 感染小鼠后,小鼠的LD50及肝脏、脾脏、脑载菌量变化差异。结果显示,本研究成功构建了srtA 基因缺失株;与亲本株LM90SB2比较,缺失株LM90SB2-ΔsrtA 对RAW264.7和SIEC的粘附率、侵袭率及胞内细菌数量均下降,且差异具有显著统计学意义(p <0.05);小鼠 LD50降低了21.38倍,肝脏、脾脏载菌量降低,差异具有显著统计学意义(p <0.05)。本研究结果表明,srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2的毒力具有关键作用,参与粘附、侵袭BMEC,该研究结果为进一步阐明单增李斯特菌毒力因子的致病机制提供理论依据。

牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库构建与筛选

旨在获得牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特异性纳米抗体。通过用BVDV-E0重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞。利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与BVDV-E0蛋白结合的噬菌体,对所得VHH序列进行测序和基因比对。用ELISA筛选出抗BVDV-E0的高亲和力纳米抗体,并验证纳米抗体的亲和力和活性。结果成功构建了插入率为86%、库容量为1.3×1011 cfu的噬菌体表达文库,经过筛选获得5个BVDV-E0阳性单克隆,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的BVDV-E0纳米抗体,经亲和力的鉴定获得2个不同的高亲和力的VHH基因,并且能结合人工抗原E0,还能够被竞争抗体所阻断。研究结果为用于组装检测BVDV试剂盒和研制BVDV疫苗奠定了基础。

运输对饲料质量的影响

采用甲基紫法和粗蛋白法对4Okm运输前后饲料混合均匀度进行了测定,甲基紫测定结果表明:在运输前后均匀度变异系数(CV％)间差异不显著(P>0.05)。对蛋白质的测定结果进行单因素方差分析,组间差异显著(P<0.05);多重比较后,下层与对照组差异显著(P<0.05),下层与中间层差异显著(P<0.05)。

模拟应用条件检测小反刍兽疫活疫苗的病毒含量

为确保小反刍兽疫活疫苗在免疫接种时的效果。本试验模拟野外操作环境,在不同稀释液、不同温度和不同放置时间条件下,检测并比较小反刍兽疫活疫苗病毒含量。结果表明,以PBS、含1%冷水鱼明胶的生理盐水、生理盐水分别稀释疫苗,1%冷水鱼明胶的生理盐水更适合作为小反刍兽疫活疫苗的稀释液。疫苗以三种不同的稀释液稀释后,在4 h内,25℃或37℃条件下,不会影响其效价。

不同微量矿物质添加剂对育肥猪生长性能及矿物元素排放的影响

试验采用单因素试验设计,选择体重和年龄相近的126头(51.7±1.7)kg杜长大三元杂交猪为试验动物,随机分成3组(无机组、有机1组和有机2组),每组3个重复,每个重复14头猪,预试期7 d,正试期为30 d。无机组矿物元素添加量参考NRC(2012)推荐量,有机1组和有机2组的矿物元素添加量分别为NRC(2012)推荐量的50%和80%。试验结果表明:有机矿物元素对猪采食量影响不明显(P>0.05),但有促进采食量增加的趋势,平均日增重和料重比有极显著改善(P<0.01),猪粪中矿物元素铜、锌和铁的排出量极显著降低(P<0.01),表现为与摄入量呈高度相关性,但血液中铁含量与摄入量间不存在关联性。试验结果提示,有机矿物元素减量替代生长育肥猪饲粮中的无机矿物元素,不仅不会影响育肥猪的生长性能,还有提高猪生长性能的作用,减少了猪粪中微量矿物元素排放量。综合认为,有机矿物元素按NRC(2012)推荐量的50%添加,能满足对生长肥育猪生长的矿物元素需要。

复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮发酵品质及瘤胃降解率的影响

本研究旨在探究接种复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮品质的影响,通过分析营养品质、发酵品质及瘤胃降解率,明确最优发酵条件,为提高资源利用率,拓宽本地区饲草料资源提供理论基础。试验采用真空袋法调制混合青贮,设计10个处理,其中5个处理不接种复合乳酸菌,混合比例(质量比)为:番茄皮渣∶苜蓿=3∶7(T_(1)),4∶6(T_(2)),5∶5(T_(3)),6∶4(T_(4)),7∶3(T_(5));另外5个处理在各混合青贮比例基础上均匀加入复合乳酸菌(布氏乳杆菌+植物乳杆菌,比例为1∶1,1×10^(6) CFU·g^(-1)),即分别为JT_(1)、JT_(2)、JT_(3)、JT_(4)、JT_(5)。发酵60 d后开袋进行感官评定,分析营养品质、发酵品质、瘤胃降解率,采用隶属函数分析法评价最优处理。结果表明:接种复合乳酸菌可改善番茄皮渣与苜蓿混合青贮的气味及质地,T_(1)、JT_(1)、T_(2)及JT_(2)处理的混合青贮感官评定为优等。接种复合乳酸菌显著提升了番茄皮渣与苜蓿混合青贮的干物质(DM)、粗蛋白(CP)、乳酸(LA)、乙酸(AA)(P<0.05),显著降低了水溶性碳水化合物(WSC)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、pH、丙酸(PA)、丁酸(BA)、氨态氮/总氮(NH3-N/TN)(P<0.05)。各混合青贮中,JT_(2)处理的DM、CP含量最高,T_(2)处理的WSC含量最高,JT_(2)处理的NDF、ADF含量最低,JT_(1)、JT_(2)处理的pH较低,JT_(1)、JT_(2)处理的LA含量较高,T_(1)、T_(2)处理的AA含量较低,JT_(1)、JT_(2)的PA、BA含量及NH_(3)-N/TN较低。瘤胃降解24 h时,接种复合乳酸菌显著提升了番茄皮渣与苜蓿混合青贮的干物质降解率(DMD)、中性洗涤纤维降解率(NDFD)、酸性洗涤纤维降解率(ADFD)(P<0.05),JT_(1)和JT_(2)处理的DMD、NDFD较高,JT_(2)处理的ADFD最高。综上,接种复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮营养品质、发酵品质及瘤胃降解率均有显著改善;将各混合青贮的14项核心指标进行隶属函数分析得出,JT_(2)处理最优,即在番茄皮渣添加量为40%(番茄皮渣∶苜蓿=4∶6,干物质含量为30.64%)的混合青贮中接种复合乳酸菌最具推广意义。

番茄皮渣与高粱秸秆混贮的发酵品质、瘤胃降解率及有氧稳定性

本试验旨在通过化学分析和瘤胃瘘管绵羊动物模型探究番茄皮渣与高粱秸秆混贮的发酵品质、瘤胃降解率及有氧稳定性,明确最优混贮比例及含水量。试验采用真空袋法调制混合青贮,按照不同的番茄皮渣:高粱秸秆混贮比例(3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3)分为5个处理(T_(1)、T_(2)、T_(3)、T_(4)、T_(5))。发酵90 d后开袋进行感官评定,分析发酵品质、有氧稳定性、瘤胃降解率,采用隶属函数分析法评价最优处理。结果表明:1)T_(1)、T_(2)处理感官评定为优等。2)T_(1)处理的干物质(DM)、水溶性碳水化合物(WSC)、粗蛋白质(CP)及乳酸(LA)含量显著高于其他处理(P<0.05),T_(1)、T_(2)处理的氨态氮/总氮(NH_(3)-N/TN),中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、丙酸(PA)、乙酸(AA)及丁酸(BA)含量及pH显著低于其他处理(P<0.05)。3)随着有氧暴露时间的延长,T_(1)、T_(2)处理的乳酸菌(LAB)数量始终显著高于其他处理(P<0.05),pH、酵母菌及霉菌数量始终显著低于其他处理(P<0.05)。4)瘤胃降解24 h时,T_(1)、T_(2)处理的干物质降解率(DMD)、有机物降解率(OMD)显著高于其他处理(P<0.05),T_(1)处理的中性洗涤纤维降解率(NDFD)显著高于其他处理(P<0.05),T_(2)处理的酸性洗涤纤维降解率(ADFD)显著高于其他处理(P<0.05)。番茄皮渣与高粱秸秆混贮发酵结束后,将混贮的18个核心指标进行隶属函数分析得出:当番茄皮渣添加量为30%(番茄皮渣∶高粱秸秆=3∶7,水分含量67.85%)时,番茄皮渣与高粱秸秆混贮的综合价值最高;当番茄皮渣添加量为30%~40%,含水量为67.85%~70.45%时,番茄皮渣与高粱秸秆混贮有氧稳定性最优。

口蹄疫病毒3C蛋白酶结构与功能及应用研究进展

口蹄疫病毒(FMDV)3C蛋白酶是FMDV基因组编码中具有酶学活性的病毒产物之一,在FMDV编码蛋白的成熟和子代病毒在宿主细胞体内大量扩增中发挥着重要作用。3C蛋白酶能剪切多聚蛋白,降解特定的蛋白质,是宿主细胞中重要的毒力因子。3C蛋白酶能调控蛋白的转录和翻译,使宿主细胞内的干扰素等多种抗病毒基因低水平表达,使FMDV逃避宿主的天然免疫。论文主要综述了FMDV 3C蛋白酶的结构、生物学功能,并介绍了其在研制新型疫苗中的应用,以期为今后FMDV 3C蛋白酶的研究、新型疫苗的研发提供参考。

含EGFP基因的马疱疹病毒1型新疆株gE基因缺失株的构建

为筛选马鼻肺炎(equine rhinopneumonitis,ER)基因缺失减毒活疫苗的候选毒株,本研究参考GenBank中EHV-1(登录号:KF644579.1)目的基因序列设计同源臂引物,以本地区流行株XJ2015株DNA为模板PCR扩增gE基因同源臂gEH1、gEH1,以EGFP表达盒(CMV+EGFP+polyA)为标记基因,酶切后依次连接至载体pUC-19,成功构建重组质粒pUC-gEH1H2-EGFP。将XJ2015基因组与质粒pUC-gEH1H2-EGFP共转染至RK-13细胞进行同源重组,以EGFP为标记进行gE基因缺失毒株的筛选及纯化,并测定重组毒株效价。结果显示:经5轮荧光噬斑纯化、PCR及测序鉴定,成功获取一株携带EGFP基因的重组毒株XJ2015-△gE-EGFP,且重组毒株效价(107.1TCID50/0.1 mL)较原毒株(108.8TCID50/0.1 mL)下降约101.7TCID50/0.1 mL。采用同源重组技术成功构建了1株马疱疹病毒1型流行株gE基因缺失突变株,为未来筛选马鼻肺炎基因缺失弱毒疫苗奠定了基础。

不同PRRS弱毒苗免疫血清对FcγRIIb介导ADE效应的影响

为了研究蓝耳病不同毒株疫苗在ADE效应下的表现,将疫苗血清复合物(用105.0TCID50的HP-PRRSV田间分离株ZJ-2014,与不同弱毒疫苗CH-1R、R98、TJM-F92的免疫血清在不同的稀释梯度下混合作用24 h,获得血清复合物)接种于PAM细胞,进行蓝耳病病毒增殖试验,检测病毒RNA拷贝数。以兔抗猪FcγRIIb血清进行封闭构建对照组,而后接种PAM细胞。通过比较封闭前后PRRS病毒增殖数量的差异,确定不同疫苗血清兔抗猪FcγRIIb多抗对ADE的阻断作用。试验结果表明:TJM-F92株疫苗的血清抗原复合物对ADE效应的阻断效果最为明显,提示在未来蓝耳病疫苗研制及临床应用中,TJMF92株可以成为优选毒株。

O型口蹄疫病毒不同宿主适应毒株P1和3A基因的差异分析

为了明确O型口蹄疫病毒不同宿主适应毒株P1和3A基因位点的差异性,研究其遗传变异趋势,找出不同宿主适应毒株在P1和3A基因水平上位点的变异情况,将O型口蹄疫病毒O/XJ/10-11株分别接种于牛、乳鼠、猪及BHK-21细胞,获得相应的宿主适应毒株,提取RNA,反转录并扩增P1和3A基因,目的片段产物经琼脂糖凝胶电泳回收,并将其克隆到pMD19-T载体上,筛选阳性菌落,测序并分析其基因序列。结果表明:牛、乳鼠、猪、BHK-21细胞四种宿主适应毒株,核苷酸和氨基酸序列均未发生缺失,主要抗原位点稳定;P1基因发生了部分变异,变异程度依次为VP1、VP2>VP3>VP4,VP4基因最为保守;3A基因较稳定,变异较少;不同宿主适应毒株的变异程度依次如下:猪适应毒株>BHK-21细胞适应毒株>牛适应毒株>鼠适应毒株。O型口蹄疫病毒在不同宿主传代过程中造成VP1基因的变异,但主要抗原位点稳定;VP2基因的变异均位于抗原表位上;鼠适应毒株作为口蹄疫原始毒种的保存更为有利。

口蹄疫病毒P1结构蛋白和3A非结构蛋白研究进展

口蹄疫病毒(FMDV)P1基因所编码的结构蛋白是FMDV衣壳的主要蛋白,是其主要抗原位点所在的区域,决定着FMDV的抗原性,3A非结构蛋白能与宿主细胞结合,其特征性变化与病毒的表型变化密切相关,影响着宿主嗜性和致病力,P1和3A基因都是FMDV研究的热点。论文综述了FMDV P1和3A基因及其所编码蛋白的结构、抗原特性及其生物学功能的研究现状,为后续FMDV研究提供参考。

干扰和过表达BAMBI基因对猪卵泡颗粒细胞表型和功能的影响

为研究转化生长因子-β(TGF-β)信号通路中的骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂(bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor,BAMBI)基因对猪卵泡颗粒细胞的调控作用,本研究设计构建BAMBI干扰和过表达载体,并将构建好的干扰(pSIREN-BAMBI-sh1、pSIREN-BAMBI-sh2、pSIREN-BAMBI-sh3)和过表达(pcDNA3.1-BAMBI)重组质粒转染猪卵泡颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR技术进行有效片段的筛选,并对TGF-β信号通路下游基因(TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5)和细胞凋亡基因(Bax、Bcl-2)mRNA的表达水平进行检测。最后,用MTT法和流式细胞术检测BAMBI干扰和过表达对卵泡颗粒细胞增殖及凋亡的影响。结果表明,BAMBI干扰和过表达载体成功构建,pSIREN-BAMBI-sh2抑制BAMBI表达的效果最好,干扰效率最高。干扰BAMBI时,TGF-βRⅡ表达量显著上升(P<0.05),使得SMAD2、SMAD3的表达量显著上升(P<0.05);过表达BAMBI时,TGF-βRⅡ表达显著下降(P<0.05),使得SMAD2、SMAD3的表达量显著下降(P<0.05);上调BAMBI可显著抑制猪卵泡颗粒细胞增殖,极显著促进猪卵泡颗粒细胞凋亡(P<0.01)。研究结果表明,BAMBI基因显著影响猪卵泡颗粒细胞的生长发育,可能通过调节TGF-β信号通路间接影响猪的繁殖性能。

口蹄疫O型病毒二温式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

试验通过对口蹄疫病毒核苷酸序列的比对分析,在O型口蹄疫病毒的P1基因保守区,设计1对特异性引物,应用均匀设计法优化反应参数,建立口蹄疫O型病毒二温式RT-PCR检测方法。对该法进行特异性试验、敏感性试验检测。结果表明,该二温式RT-PCR方法只对口蹄疫O型病毒敏感,对其他血清型的口蹄疫病毒及常见的猪病病毒均不敏感;扩增条带与预期目的片段大小相符,扩增片段经克隆、测序发现与引物所在基因序列的同源性为100%;检测病毒RNA的敏感性为1.665pg/μL,其敏感性与三步法PCR敏感性检测结果没有差异。运用该法对54头攻毒试验的动物进行检测,阳性鉴定结果与三步法PCR鉴定结果一致,与三步法PCR相比该法节省了20min,表明所建立的口蹄疫O型病毒二温式RT-PCR方法是一种准确、快速、特异、敏感的检测方法。

添加植酸酶对生长猪生产性能及养分消化率影响的研究

试验选用60头体质健康、平均体重为31.3±2.2kg的三元杂交(杜×长×大)生长猪,随机分为3组进行饲养试验和消化试验,以研究棉粕代替豆粕的生长猪日粮中添加植酸酶的效果。结果表明:"玉米+豆粕+棉粕"型日粮中添加400U/kg的植酸酶生长猪日增重比对照组提高14.39%(P<0.05),对采食量和料重比影响不明显;可明显提高钙、磷的消化率,但对干物质、粗蛋白质的表观消化率没有显著影响。