参附方对颅脑损伤大鼠亚低温期冷诱导RNA结合蛋白表达的影响

目的：从冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）表达推测参附方辅助亚低温治疗颅脑损伤的作用机制。方法将SD大鼠按随机数字表法分为非转染对照组、腺病毒介导免疫荧光逆转录病毒组（AD5-GFP转染组）及腺病毒介导携CIRP静默表达基因免疫荧光逆转录病毒组（AD5-GFP-CIRP-SiRNA转染组），每组30只；再将3组分为颅脑损伤和亚低温治疗模型组、中药低、高剂量组，每组10只。中药组于亚低温治疗48 h后经尾静脉注射参附注射液1 mL/kg（低剂量组）和5 mL/kg（高剂量组），模型组注射1 mL/kg生理盐水，均每日1次，连用2 d。两个转染组先采取病毒载体大鼠鞘内给药复制病毒转染模型〔分别一次性鞘内注射0.1 mL空白AD5-GFP和0.1 mL（1×1010 pfu/mL）AD5-GFP-CIRP-SiRNA，非转染对照组给予0.1 mL生理盐水〕。取大鼠脑皮质、海马区、下丘脑部位脑组织，用原位末端缺刻标记试验（TUNEL）测定脑细胞凋亡情况，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定CIRP mRNA表达，蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）测定大鼠肉瘤蛋白（Ras）、 Ras活化相关因子（Raf）、细胞外信号调节激酶（ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）、丝裂原活化蛋白激酶 ERK（MEK）、磷酸化MEK（p-MEK）的蛋白表达量。结果非转染对照组、AD5-GFP转染组中药低、高剂量组脑皮质、海马区、下丘脑AI均较模型组降低，CIRP mRNA表达均较模型组升高；AD5-GFP-CIRP-SiRNA转染组中模型组和中药低、高剂量组脑皮质、海马区、下丘脑AI及CIRP mRNA表达差异均无统计学意义，但AI均明显高于非转染对照组和AD5-GFP转染组相应组，CIRP mRNA明显低于非转染对照组和AD5-GFP转染组相应组。各组各部位Raf/Ras、p-MEK/MEK 蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），非转染对照组、AD5-GFP转染组中药低、高剂量组脑皮质、海马区、下丘脑p-ERK/ERK均较模型组降低，且以中药高剂量组降低更显著〔脑皮质：非转染对照组为7.2±1.0比15.3±1.8，AD5-GFP转染组为8.1±0.7比16.2±1.5；海马区：非转染对照组为6.6±0.8比14.7±2.0，AD5-GFP转染组为6.8±1.0比14.9±1.3；下丘脑：非转染对照组为9.4±1.1比12.7±1.7，AD5-GFP转染组为10.6±1.3比9.4±1.1，均P＜0.05〕；AD5-GFP-CIRP-SiRNA转染组各亚组各部位p-ERK/ERK比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论参附注射液可能通过促进CIRP过表达，降低ERK表达，抑制继发的转录因子磷酸化的启动信号转导，从而减少神经细胞凋亡，发挥其辅助亚低温治疗的抗凋亡作用。