间歇低氧选择性激活内皮细胞转录因子-κB核内转位的研究

目的:探讨间歇低氧/再氧合(IH/ROX)和持续低氧(CH)条件下的内皮细胞转录因子(NF)-κB核内转位情况及其诱导的炎症损伤。方法:在细胞培养舱中程控产生预置的IH/ROX和CH暴露条件,将人脐静脉内皮细胞可传代细胞株ECV304暴露于该环境;采用酶联免疫吸附法测定内皮细胞核/质抽提物中NF-κB的光密度标化水平和培养基中白细胞介素(IL)-6的浓度。结果:在IH/ROX循环时,内皮细胞实际动脉O2分压的暴露条件为(76.28±1.29)mmHg～(54.94±1.05)mmHg,可以模拟睡眠呼吸暂停时内皮细胞暴露条件。IH组核内NF-κB的光密度标化水平明显高于低氧累计时间和程度相同的CH组(P<0.01);无论核内NF-κB水平还是培基IL-6浓度,CH累加IH组均低于IH组(均P<0.01);经过120min恢复,IH组核内NF-κB仍未恢复至对照组水平(P<0.01),而CH组核内NF-κB水平始终没有明显变化(P>0.05);胞浆NF-κB水平在各组间差异无统计学意义(均P>0.05)。结论:IH/ROX暴露时,是ROX时相而非IH时相导致NF-κB总含量增加且核内转位,诱导炎症产生,其程度明显强于CH;即使IH暴露结束以后,炎症反应基础在相当长时间内仍持续存在。

不同间歇低氧与持续低氧模式家兔在体颈动脉体和颈总动脉模型的建立

目的探讨建立不同间歇低氧(IH)程度、IH时间和再氧合(ROX)时间以及持续低氧(CH)模式家兔在体颈动脉体和颈总动脉模型。方法由计算机程序控制单片机,在串口通讯协议驱动下,由下位机芯片控制不同氧分压(PO2)灌注液的灌注过程。45只成年雄性新西兰大耳白家兔(2.5～3.0kg)复合麻醉后保留自主呼吸,游离右侧颈总动脉和窦神经(CSN),显露CSN化学感受性神经细束并安放电极记录CSN传入活性。结扎右侧颈总动脉向心端血流,并向右侧颈总动脉远心端内插入导管,经蠕动输液泵交替灌注以发泡法预平衡的灌注液(2mL/min)。灌注低氧灌注液,而后再灌注正常氧灌注液,交替往复形成IH/ROX循环,从而在颈总动脉内模拟出睡眠呼吸暂停状态的不同IH模式IH/ROX暴露情况;或持续灌注低氧液以模拟CH暴露情况。监测颈动脉体CSN传入活性,完成暴露后游离收集颈动脉体和插管远心端的颈总动脉及其分叉作为标本。结果正常氧灌注时CSN化学传入细束的基线频率为(0.17±0.03)次脉冲/s(impulse/s),平均波幅为(46.2±4.4)μV;低氧灌注时传入频率为(0.64±0.09)impulse/s,平均波幅为(87.4±6.6)μV;正常氧灌注液的PO2约为(139±1.5)mmHg,而IH灌注液的PO2约为(35.2±1.3)mmHg。结论该模型可以用于研究不同IH和CH模式时颈动脉体和颈总动脉多种神经和生物化学变化,具有较大的应用价值。

pcDNA3.1/hTSHR_(1043～1354 bp)重组体的构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp及在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达hTSHR膜外区氨基酸314～418蛋白分子。方法提取人正常甲状腺组织总RNA,反转录后进行聚合酶链反应(PCR),将纯化的扩增产物hTSHR1043～1354bp与表达载体pcDNA3.1连接后转化TOP10E.coli感受态菌。经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定插入序列和方向正确的重组质粒转染CHO细胞,并用Westernblot方法鉴定表达的蛋白。结果PCR扩增得到hTSHR膜外区C端312bp的基因片段hTSHR1043～1354bp。该片段与表达载体pcDNA3.1的连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHR1043～1354bp片段插入序列和方向正确。重组质粒转染的CHO细胞裂解液经Westernblot可以检测出15900的蛋白条带,与预期的蛋白相对分子质量相符。结论成功构建了重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp,其转染CHO细胞后表达159000的目的蛋白(hTSHR氨基酸314～418蛋白片段)。

人促甲状腺激素受体膜外区N端基因免疫诱导Balb／c小鼠实验性格雷夫斯病

目的观察人促甲状腺激素受体（human thyrotropin receptor，hTSHR）膜外区N端（氨基酸29-280区域）的抗原性及其与格雷夫斯病（Graves病）发病的关系。方法提取人正常甲状腺组织总RNA．反转录后进行PCR，扩增产物与表达载体pcDNA3．1进行连接得到重组质粒pcDNA3．1／hTSHR188-940bp。用重组质粒免疫Balb／c小鼠，检测小鼠血清中甲状腺素（thyroxin，T4）、抗TSHR抗体（anti-TSHR antibody，TRAb）、甲状腺刺激抗体（thyroid stimulating antibody，TSAb）水平的变化，光镜下观察甲状腺组织的结构变化。结果 PCR扩增得到hTSHR膜外区N端753bp的基因片段hTSHRl％～％bD，该片段与表达载体pcDNA3．1连接后，经HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHR180-940bp片段插入序列和方向正确。用pcDNA3．1／hTSHR180-940bp免疫Balb／c小鼠后发现，血清TRAb水平从第6周（0．148±0．018）开始升高，到第10周（0．134±0．011）一直维持在比较高的水平，与第0周（0．106±0．006）比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。血清T4、TSAb水平在第10周[（62．20±12．77）μg／L、1．392±0．615]出现明显升高，与第0周[（41．02±7．97）μg／L、0．864±0．076]比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。甲状腺病理学检查发现大部分小鼠甲状腺滤泡上皮增生，滤泡腔增大，偶见炎细胞浸润。结论TSHR188-940bp编码的hTSHR膜外区N端氨基酸29-280区域抗原决定簇使机体产生TSAb，从而导致甲状腺功能亢进，出现类Graves病表现，说明偈HR的这个区域与Graves病密切相关，可能是导致该病的重要因素。

不同频率间歇低氧暴露后兔颈动脉体的炎症状态和窦神经传入活性

目的建立不同间歇低氧／再氧合（IH／ROX）模式家兔颈动脉体在体模型，探讨不同频率IH／ROX暴露后家兔颈动脉体的炎症状态、内皮素水平和颈动脉体窦神经传入活性。方法49只成年雄性大耳白家兔（2．5～3．0kg）分为7组，每组7只，分离右侧颈总动脉和右窦神经，窦神经去包膜显露髓鞘，游离化学感受性神经细束记录窦神经传入活性。结扎近心端，远心端内插入导管，经程控蠕动泵交替灌注以发泡法预平衡的低氧灌注液和（或）正常氧灌注液，在右侧颈总动脉内模拟睡眠呼吸暂停模式IH／ROX暴露条件或持续低氧条件。按灌注频率分组为：间歇正常氧组（21％O2，15S；21％O2，1min45S）、10次／h组（21％O2，5min45S）、30次／h组（21％02，1min45S）、50次／h组（21％O2，57s）、60次／h组（21％O2，45s）、90次／h组（21％O2，25S），均反复灌注60次；持续低氧组：间歇正常灌注1h45min，随后给予5％O2持续15min。静置30min，采集窦神经传入活性频率（ChargeF），游离收集右侧颈动脉体，酶联免疫吸附法（ELISA法）测定颈动脉体裂解液中白细胞介素-6（IL-6）、内皮素-1、低氧诱导因子-1（HIF-1）和血管内皮生长因子（VEGF）浓度并标准化。整体比较时采用单因素方差分析，配对比较用TamhaneT2法。结果随着间歇正常氧频率增加，IL-6、内皮素-1和ChargeF整体均数呈现出先升后降趋势（F=25601．39，2390．48，6945．84，均P〈0．05），50／hr组IL-6、内皮素-1和ChargeF水平均高于其余各组。且ChargeF与IL-6和内皮素-1相关（r=0．736，0．757，均P〈0．05）；而组间IL-6、内皮素-1和ChargeF水平差异不明显。随着间歇低氧频率增加，HIF-1水平逐渐增加（F=5241．10，P〈0．01），持续低氧组HIF-1水平最高。VEGF水平呈现出先升后降再升趋势（F=5931．30，P〈0．05），持续低氧组VEGF水平增加最明显。结论IH／ROX暴露后颈动脉体窦神经传入活性明显增强并与颈动脉体炎症和血管收缩密切相关，颈动脉体的炎症来源于再氧合时段而非来源于间歇低氧时段，这一过程受到IH／ROX频率的影响。随着IH／ROX频率的不断增加，颈动脉体炎症状态、内皮素水平和窦神经长期易化先是逐渐增加，而后再逐渐下降。15min的持续低氧未造成明确的炎性损伤，而HIF-1和VEGF是IH／ROX适应性通道成员。