人促甲状腺激素受体膜外区N端基因免疫诱导Balb／c小鼠实验性格雷夫斯病

目的观察人促甲状腺激素受体（human thyrotropin receptor，hTSHR）膜外区N端（氨基酸29-280区域）的抗原性及其与格雷夫斯病（Graves病）发病的关系。方法提取人正常甲状腺组织总RNA．反转录后进行PCR，扩增产物与表达载体pcDNA3．1进行连接得到重组质粒pcDNA3．1／hTSHR188-940bp。用重组质粒免疫Balb／c小鼠，检测小鼠血清中甲状腺素（thyroxin，T4）、抗TSHR抗体（anti-TSHR antibody，TRAb）、甲状腺刺激抗体（thyroid stimulating antibody，TSAb）水平的变化，光镜下观察甲状腺组织的结构变化。结果 PCR扩增得到hTSHR膜外区N端753bp的基因片段hTSHRl％～％bD，该片段与表达载体pcDNA3．1连接后，经HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHR180-940bp片段插入序列和方向正确。用pcDNA3．1／hTSHR180-940bp免疫Balb／c小鼠后发现，血清TRAb水平从第6周（0．148±0．018）开始升高，到第10周（0．134±0．011）一直维持在比较高的水平，与第0周（0．106±0．006）比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。血清T4、TSAb水平在第10周[（62．20±12．77）μg／L、1．392±0．615]出现明显升高，与第0周[（41．02±7．97）μg／L、0．864±0．076]比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。甲状腺病理学检查发现大部分小鼠甲状腺滤泡上皮增生，滤泡腔增大，偶见炎细胞浸润。结论TSHR188-940bp编码的hTSHR膜外区N端氨基酸29-280区域抗原决定簇使机体产生TSAb，从而导致甲状腺功能亢进，出现类Graves病表现，说明偈HR的这个区域与Graves病密切相关，可能是导致该病的重要因素。

pcDNA3.1/hTSHR_(1043～1354 bp)重组体的构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp及在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达hTSHR膜外区氨基酸314～418蛋白分子。方法提取人正常甲状腺组织总RNA,反转录后进行聚合酶链反应(PCR),将纯化的扩增产物hTSHR1043～1354bp与表达载体pcDNA3.1连接后转化TOP10E.coli感受态菌。经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定插入序列和方向正确的重组质粒转染CHO细胞,并用Westernblot方法鉴定表达的蛋白。结果PCR扩增得到hTSHR膜外区C端312bp的基因片段hTSHR1043～1354bp。该片段与表达载体pcDNA3.1的连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHR1043～1354bp片段插入序列和方向正确。重组质粒转染的CHO细胞裂解液经Westernblot可以检测出15900的蛋白条带,与预期的蛋白相对分子质量相符。结论成功构建了重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp,其转染CHO细胞后表达159000的目的蛋白(hTSHR氨基酸314～418蛋白片段)。