大鼠bFGF基因荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立用荧光定量PCR方法检测大鼠bFGF基因mRNA水平。方法以Trizol一步法提取新鲜骨组织总RNA，以Oligo（dt）18为引物逆转录产生cDNA并进行扩增，以T-A克隆法将纯化的目的片断与PGEM—T Easy载体连接成重组质粒并转化E．coli DH5α。采用碱裂解法提取重组质粒，经蓝白筛选、酶切、测序鉴定后，根据标准品建立标准曲线，由软件自动计算出待测样本中靶基因mRNA准确含量，并以靶基因和内参GAPDH mRNA含量的比值作为评价靶基因表达水平的指标。结果由PGEM-T Easy—bFGF所构建的标准曲线线性关系良好（反应体系中含1×10^2～1×10^7拷贝大鼠bFGF基因分子时，扩增反应α值与拷贝数的对数成线性关系）、灵敏度高、特异性强、准确可靠。批内和批间重复性测定的变异系数分别为1．03％～4、59％以及2．24％～6．46％。结论成功建立了用实时荧光定量PCR检测大鼠bFGF基因表达量的方法。