GST-G3BP Domain 1～5原核表达质粒的构建及其表达

目的:构建GST-G3BP Domain1～5的融合表达质粒,并在大肠杆菌中稳定表达。方法:PCR扩增G3BP Domain1～5片段,利用限制性内切酶EcoRI和NotI将其连接至载体pGEX-4T-1,将连接产物转化大肠杆菌,挑取单菌落,提取质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序。将转化正确的大肠杆菌过夜培养,IPTG诱导融合蛋白表达,immobilized Glutathione beads钓取目的蛋白。结果:G3BP Domain1～5片段均成功连接至载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21中可得到稳定表达的融合蛋白。结论:GST-G3BP Domain1～5的融合表达质粒构建成功。

P100蛋白及其片段重组质粒构建与表达

目的分别将人类p100基因，p100的SN基因片段和TD片段定向连入pERFP-CI质粒，使它们可与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达，从而为进一步研究P100蛋白及其片段的定位、功能及与其它蛋白的相互关系奠定实验基础。方法PCR分别扩增出P100蛋白全长，SN片段和TD片段基因的序列，定向克隆至真核表达载体pERFP-CI，构建相应的3种重组质粒。将构建成功的质粒转染入HeLa细胞，荧光显微镜下可观察红色荧光融合蛋白表达。结果①PCR法获得P100基因序列，长度为2659bp，SN基因片段1918bp，TD基因片段741bp；②将重组质粒直接进行双酶切鉴定可见P100片段，将经过蓝白斑筛选后的重组子经双酶切再与pERFP-CI载体连接并酶切得到SN片段和TD片段；③转染重组质粒后可观察到红色荧光蛋白的表达。结论3种外源片段成功载人pERFP-CI质粒；P100全长、SN片段、TD片段均可与红色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。