可磷酸化底物肽促进基因转染效率的研究

目的进一步探讨可磷酸化碱性短肽提高短肽作为基因转移载体的转染效率。方法合成基序为LLL-RRRDNEY*FY*VRRLL的短肽(SP),以体外磷酸化实验观察哺乳动物细胞裂解液使SP磷酸化并促进SP/DNA复合物种DNA的释放。以荷荧光素酶报告基因的SP/DNA复合物转染C2C12细胞,观察转染效率。结果细胞裂解液可有效地使可磷酸化短肽发生磷酸化,并促进DNA与SP的解离。可磷酸化短肽对C2C12细胞的转染效率显著高于不可磷酸化短肽。结论可磷酸化短肽可以显著提高短肽的转染效率,外源DNA与SP载体在细胞内的解离情况对SP/DNA复合物的转染效率具有重要影响。

碘对大鼠体内及体外甲状腺钠碘转运体mRNA表达的调节

目的探讨碘过量对体内、体外甲状腺钠碘转运体(NIS)mRNA表达的影响。方法Wistar大鼠,随机分为低碘组(LI)、适碘组(NI)、5倍高碘组(5HI)、10倍高碘组(10HI)、50倍高碘组(50HI)、100倍高碘组(100HI),检测尿碘、甲状腺NISmRNA表达水平。FRTL细胞分别在含有10-6～10-3mol/L碘化钾的培养基中培养24、48h,检测NISmRNA水平的变化。结果LI组尿碘显著低于NI组,而甲状腺NISmRNA表达水平明显高于NI组(P<0.01);各高碘组尿碘与NI组比较呈成倍升高,NISmRNA水平与NI组相比逐渐下降。FRTL细胞在分别含有10-6～10-3mol/L碘化钾的培养基中培养24、48h,NISmRNA的表达水平与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论碘对体内、体外甲状腺NISmRNA表达的影响存在不同的机制,长期、慢性处于高碘摄入的大鼠主要通过转录水平影响甲状腺NISmRNA的表达,而体外急性实验表明,高碘则可能通过转录后水平而起作用。

可磷酸化短肽偶联壳聚糖促进CS/DNA转染效率

合成基序为LLLRRRDNEY*FY*VRRLL的短肽(pSP),其中含有两个可被JaK2蛋白激酶磷酸化的酪氨酸残基.将此短肽与壳聚糖(CS)相偶联,体外磷酸化及DNA释放实验检测哺乳动物细胞裂解液对短肽的磷酸化及pSP-CS/DNA复合物中DNA释放的影响.放射性标记DNA转移实验验证pSP-CS/DNA复合物的入胞能力后,将荷荧光素酶或GFP报告基因的质粒与pSP-CS制成pSP-CS/DNA复合物,转染体外培养的C2C12小鼠成肌细胞,观察GFP的分布及细胞裂解液中的荧光素酶活性以表征转染效率.继而进行多种细胞系的转染,衡量pSP偶联的壳聚糖对不同种属细胞的转染效率.结果表明,哺乳动物细胞裂解液可有效地使短肽发生磷酸化,并藉此促进DNA与壳聚糖载体的解离.以pSP修饰的壳聚糖进行转染时,细胞裂解液的荧光素酶活性可达普通壳聚糖转染的两倍,细胞中GFP的含量也明显增加.据此推论,短肽被磷酸化后产生电荷属性的改变,促进DNA与壳聚糖载体的解离从而显著提高壳聚糖的转染效率.

^pSP偶联低分子量壳聚糖介导siRNA对靶基因的沉默

放射性标记针对荧光素酶报告基因(Luc)的siRNA,与不同分子量的壳聚糖(CS)制备成CS/siRNA复合物,转染可稳定表达Luc基因的MDA-MB-231/Luc人乳腺癌细胞系.与较大分子量壳聚糖相比,低分子量壳聚糖(LMWC)与siRNA形成的复合物具有更小的粒径及更强的siRNA转染能力,但是对靶基因的沉默效应却不高.其原因归咎于低分子量壳聚糖(Mr为2 000或5 000,LMWC)与siRNA间强烈的电荷引力限制了siRNA在细胞内的释放.合成基序为LLLRRRDNEY*FY*VRRLL的可磷酸化短肽(p SP)与LMWC相偶联,合成p SP-LMWC.分别对siRNA及p SP-LMWC进行FAM及Dabcyl标记,利用FRET技术检测细胞内p SP-LMWC与siRNA的解离.结果表明,p SP修饰可大幅度增加siRNA与LMWC在细胞内的解离,成为有功能的游离形式,从而显著下调靶基因的表达.本文的结果表明,低分子量壳聚糖具有良好的siRNA递送能力,促进其与siRNA在细胞内的解离可有效提高siRNA对靶基因的沉默效应.

重组人维甲酸X受体α的克隆与表达及其与甲状腺受体的结合

维甲酸X受体α(Retinoid X receptor-α,RXR-α)属于核受体家族,在调节基因转录及信号转导方面发挥着重要的作用。为了深入研究RXR-α的生物学作用,文章利用RT-PCR技术扩增了人RXR-α基因,并将其克隆入原核表达载体pQE-30Xa,转化大肠杆菌M15[PREP4],异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE可见与预期大小相符的蛋白条带,Western blotting证实该条带为重组人RXR-α蛋白,并用Ni2-NTA柱进行亲和层析纯化。免疫共沉淀结果显示其具有与TRβ1结合的能力。电泳迁移率改变实验(EMSA)显示RXR-α与TRβ1形成的杂二聚体具有与DNA结合的能力。结果显示,文章已成功建立了重组人RXR-α的大肠杆菌表达系统,表达产物具有很好的生物学活性。

邻苯二甲酸二丁酯对大鼠血清雌二醇水平的影响及其机制研究

目的探讨邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对青春期雌性大鼠雌二醇(E2)合成的影响及相关机制。方法将32只21日龄SPF级SD雌性大鼠按体重随机分为对照组(玉米油)和低(250mg/kg)、中(500mg/kg)、高剂量(1000mg/kg)DBP染毒组,每组8只。采取灌胃方式进行染毒,染毒剂量为5ml/kg,每天1次,连续灌胃染毒8周。染毒结束后,处死处在动情前期的动物,采用放射免疫法检测血清中E2的水平,实时荧光定量RT-PCR检测大鼠卵巢甾体激素合成过程中关键酶细胞色素P450芳香化酶(cytochrome P450 aromatase,P450arom)mRNA表达水平。结果与对照组比较,中剂量DBP染毒组雌性大鼠体重较高,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各剂量DBP染毒组雌性大鼠血清中E2水平和卵巢P450arom mRNA表达水平均升高,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论DBP可使青春期雌性大鼠血清中E2水平升高,其作用机制可能与卵巢甾体激素合成过程中的关键酶P450arom mRNA表达升高有关。

不同孕期补充甲状腺激素对子鼠脑组织生长相关蛋白-43表达的影响

目的研究不同孕期低碘孕鼠补充甲状腺激素对子鼠脑组织生长相关蛋白（GAP）-43表达的影响，探讨甲状腺激素不足造成的脑发育落后现象的可能机制。方法1月龄Wistar大鼠160只，雌、雄各半。雌性大鼠随机分为8组：正常组和7个低碘组，每组10只。各组均饲以低碘饲料，正常组饮用碘浓度为200ug／L的碘酸钾溶液，总碘摄入量相当于大鼠生理碘需要量，低碘组饮用去离子水。3个月后，与正常Wistar雄鼠进行交配。选择1个低碘组不补充甲状腺激素作为阴性对照，其余6组分别在妊娠早期（孕1～17d）和妊娠中、晚期（孕18d-出生后20d）补充高、中、低剂量甲状腺激素，剂量分别为：3．5、2、0．5ug／100g体重。8组分别取新生当天、生后7d、14d、21d、28d的子鼠脑组织，应用SABC法检测GAP-43在神经细胞中的表达，图像分析方法定量检测蛋白的含量。结果低碘组不同日龄子鼠脑组织GAP-43的表达普遍低于同日龄正常组（P〈0．05），只有在28d时大于正常组（P〈0．05）；对低碘孕鼠给予中、高剂量的甲状腺激素，可以使子鼠脑组织GAP-43的表达接近正常水平，尤其是在孕早期补充甲状腺激素（P〈0．05）。结论孕鼠低碘导致子鼠脑组织GAP-43表达降低，低碘孕鼠补充中剂量以上的甲状腺激素，可以使子代GAP-43的表达水平接近正常，在孕早期补充效果更好。