基于TBL的主题式综合实验应用于临床免疫学检验实验教学的初探

临床免疫学检验是医学检验技术专业的一门支柱性专业课程,实践性和操作性非常强。在实验教学过程中,基于主题式教学(TBL)模式,将分散的实验内容整合成几个涵盖多个知识点和实验项目的主题式综合实验,引导学生统筹学习综合实验中的不同实验项目,分析理解其内在联系,对提升临床免疫学检验课程的教学效果意义重大。

孕妇血清妊娠相关蛋白A鲁米诺氧通道免疫测定方法的建立

目的：建立孕妇外周血妊娠相关蛋白A的鲁米诺氧通道免疫测定方法。方法：采用1株鼠抗人PAPP-A单克隆抗体用于生物素标记，兔抗人PAPP-A多克隆抗体包被受体微球，与包被有链霉亲和素的供体微粒共同构成检测试剂，优化检测条件并评价检测性能。结果：本方法的批内及批间精密度为5.91％～7.94％和6.14％～9.69％；分析灵敏度2.8 mU／L，功能灵敏度4.6 mU／L，在2.8～8000 mU／L范围内线性良好；回收率为96.7％～100.3％，通过干扰性实验分析溶血、黄疸和脂血的干扰率均＜10％；当PAPP-A浓度高达8000 mU／L时，无Hook效应；本文所建立方法检测50份临床标本，结果与时间分辨荧光分析法的结果相关系数为0.989。结论：本研究建立的方法能够用于孕妇血清PAPP-A的定量测定，检测性能符合临床诊断试剂的要求。

中性粒细胞胞外诱捕网促进类风湿关节炎血管新生的初步研究

目的研究中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)对类风湿关节炎(RA)炎症尤其是血管新生的作用。方法取RA及骨关节炎(OA)患者的滑膜组织切片行组织免疫荧光染色,观察NETs在关节滑膜中的存在情况。分离健康人外周血中性粒细胞,刺激NETs形成,并提取NETs作为刺激剂。MTT评估NETs对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)及RA滑膜成纤维细胞(RAFLS)增殖的影响,分别对HUVECs组和RAFLS组处理如下:对照(等体积培养基);NETs(0.28 mg/L NETs)。细胞划痕实验评估NETs对HUVECs迁移能力的影响,分为3组:对照组、血管内皮生长因子组(40μg/L VEGF)和NETs组(0.28 mg/L NETs)。结果 (1)与OA相比,RA滑膜组织中有较多的NETs存在。(2)体外培养的中性粒细胞刺激后可形成NETs,提取的NETs-DNA浓度为27.8 mg/(L·106细胞)。(3)MTT实验结果显示,分别与各自对照组相比,低浓度NETs(0.28 mg/L)可以促进HUVECs(0.499±0.011 vs.0.393±0.009,P<0.05)及RAFLS(0.266±0.007 vs.0.192±0.007,P<0.05)增殖。(4)划痕实验显示,低浓度NETs(0.28 mg/L)可促进血管内皮细胞迁移。结论 RA滑膜组织中有较多的NETs存在,低浓度NETs可以促进血管新生。

TNF-α和CRT双信号对RA患者滑膜组织NLRP3炎症小体的活化作用

目的研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和钙网织蛋白(CRT)双信号对类风湿性关节炎(RA)患者成纤维样滑膜细胞(FLS)中核苷酸结合寡聚化结构域受体3(NLRP3)炎症小体活化的影响。方法采用间接免疫荧光染色法检测12例RA和10例骨性关节炎(OA)患者滑膜组织NLRP3、衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的表达,并与滑膜衬里层和衬里下层FLS标志物进行共定位研究。采用胶原酶消化法分离RA患者滑膜组织中FLS并进行体外培养。分别用不同浓度的TNF-α或脂多糖(LPS)(刺激剂)处理细胞,采用免疫印迹法和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞NLRP3、白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)和白细胞介素18前体(pro-IL-18)的蛋白和mRNA表达。加入尼日利亚菌素(Nigericin)或CRT后采用免疫印迹法检测FLS中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1(Caspase-1)活化片段p20的表达;收集细胞培养上清液,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测分泌型白细胞介素(IL)-1β和IL-18水平。结果 RA患者滑膜组织中NLRP3炎症小体的主要成分NLRP3和ASC的平均荧光强度高于OA患者(P<0.01)。NLRP3、ASC和IL-1β裂解片段(cleaved IL-1β)与RA患者滑膜衬里层FLS表面标志物PDPN和衬里下层FLS表面标志物CD248均有共定位。体外细胞实验结果显示TNF-α可以促进FLS中NLRP3和pro-IL-1β的蛋白表达;与对照组(无刺激剂)相比,二者的mRNA表达显著增加(P<0.05、P<0.001),而LPS对RA患者FLS中NLRP3炎症小体的预活化无影响。TNF-α/Nigericin或TNF-α/CRT双信号能够促进FLS中Caspase-1的活化,导致Caspase-1活化片段p20呈浓度依赖性升高;与对照组相比,TNF-α/CRT组分泌型IL-1β显著升高(P<0.05)。结论 TNF-α/CRT双信号可促进RA患者FLS中NLRP3炎症小体的活化。

抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎合并间质性肺疾病患者临床分析

目的探讨抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎(AAV)合并间质性肺疾病(ILD)患者临床特点及相关危险因素,比较不同ANCA血清型间质性肺病患者的胸部高分辨率CT(HRCT)特征。方法回顾性分析2010年1月1日至2017年4月30日就诊于天津医科大学总医院的125例AAV患者临床资料,根据有无合并ILD分组,比较2组患者临床特点;将82例AAV-ILD组根据ANCA血清型分组,应用t检验、χ^2检验/Fisher确切概率法统计分析,比较2组胸部HRCT表现特征;采用Logistic回归模型分析AAV合并ILD相关危险因素。结果125例AAV患者,合并ILD 86例(68.8%)。AAV-ILD组患者平均发病年龄明显高于无间质性肺病组(NILD)[(66±11)岁和(56±15)岁,t=-3.78,P=0.001]。AAV-ILD组患者多有咳嗽、咳痰症状(χ^2=4.676,P=0.031),且血清CEA水平(t=-1.908,P=0.012)、CA199水平(t=-2.286,P=0.025)及CA153水平(t=-2.857,P=0.007)高于NILD组。比较AAV-ILD患者胸部HRCT显示,MPO-ANCA阳性组较PR3-ANCA阳性组更易出现肺纤维化(χ^2=7.736,P=0.005)、弥漫网格影(χ^2=9.762,P=0.002)及蜂窝影(χ^2=4.278,P=0.039)。多因素Logistic相关危险因素分析显示:年龄>65岁[OR(95%CI):3.305(1.280,8.531),P=0.013]和BVAS评分≥15分[OR(95%CI):3.249(1.280,8.247),P=0.013]为AAV合并ILD患者危险因素,而PR3-ANCA阳性[OR(95%CI):0.063(0.005,0.851),P=0.037]提示合并ILD概率低。结论ILD为AAV患者常见肺损害,尤其老年患者。血清癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA)199、CA153水平的升高可能是肺间质病变的预警标志。MPO-ANCA阳性患者肺部HRCT可能更易出现肺纤维化。

嗜碱性粒细胞活化试验在过敏性疾病的临床应用进展

由于城市化和全球化的持续发展、人类生活方式改变、环境污染严重,近年来,全球过敏性疾病发病率增长迅速,患病率已高达22％,主要包括过敏性鼻炎、过敏性哮喘和变应性皮炎等,严重影响了人们尤其是儿童的生活质量和健康. 临床上对于过敏性疾病的常见诊断方法主要包括病史收集和实验室检测.病史收集易受主观因素影响,存在不确定性.实验室检测方法包括体内激发试验和体外血清特异性免疫球蛋白E（specific Immunoglobulin E,sIgE）检测。

血清淀粉样蛋白A通过B类I型清道夫受体途径促进类风湿关节炎血管新生

目的研究血清淀粉样蛋白A（SAA）通过B类I型清道夫受体（SR—B1）途径对RA血管新生的作用。方法取RA及OA患者的关节滑膜组织切片行免疫组织化学染色，观察SR—BI在关节滑膜中的表达及组织定位。选用人脐静脉内皮细胞（HUVECs），免疫荧光技术检测SR—B1在内皮细胞上的表达；细胞划痕实验和体外细胞管腔形成实验评估在SAA刺激下、SR-B1受体阻断／不阻断时对内皮细胞迁移及管腔形成能力的影响。采用t检验及单因素方差分析进行统计学分析。结果①与OA对照组（积分A值6788±819）相比，RA患者关节滑膜组织中SR-B1呈显著高表达（积分4值31849±6977，t=3．567，P〈0．01），且在血管内皮细胞及血管周围区域可见较强阳性染色。②内皮细胞表面SR—B1高表达。③与空白对照组（迁移指数1．00±0．09）相比，SAA可促进血管内皮细胞迁移（迁移指数2．50±0．17，q=14．38，P〈0．01）；应用抗体阻断SR-B1受体后内皮细胞迁移能力显著降低（迁移指数1．16±0．14和SAA组，q=13．02，P〈0．01）。④与空白对照组（分支节点数6．6±0．8）相比，SAA可促进内皮细胞形成分枝状毛细管样管腔结构（分支节点数19．0±1．1，q=25．04，P〈0．01）；阻断SR-B1后内皮细胞管腔形成能力被显著抑制（分支节点数7．6±1．3和SAA组，q=23．32，P〈0．01）。结论SAA可通过与SR—B1结合进而促进RA关节部位的血管新生。

类风湿关节炎患者中钙网蛋白抑制肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体介导的T细胞凋亡研究

目的研究钙网蛋白（CRT）对TNF相关的凋亡诱导配体（TRAIL）介导的RA患者T细胞凋亡机制的影响。方法选取RA患者23例，OA患者（对照组）36例，ELISA检测CRT在滑液中的表达；免疫组织化学染色检测CRT在滑膜组织中的表达。选用体外Jurkat T细胞培养模型，ELISA检测CRT与TRAIL体外结合能力；四甲基偶氮唑蓝（MTr）法分析TRAIL对Jurkat T细胞增殖的影响；流式细胞术分析CRT抑制TRAIL诱导的细胞早期凋亡的情况。采用t检验和SNK-q检验进行统计学分析。结果①与OA对照相比，RA患者滑液与滑膜中的CRT表达量显著增加[（5．6±2．5）ng／ml和（3．2±1．3）ng／ml，t=6．233，P〈0．05；32787±18294和7945±2765，t=15．662，P〈0．01]。②当TRAIL浓度分别为1p,g／ml和2p,g／ml时，与对照组相比，与CRT结合百分率分别增加至[（117±9）％和（155±14）％，q=3．858，8．647；P〈0．01]，且二者结合呈剂量依赖关系。③TRAIL对Jurkat T细胞的增殖有抑制作用：12h时，100ng／ml TRAIL处理组细胞显示出对增殖的抑制作用（q=7．532，P〈0．05）；24h时，50ng／ml和100ng／ml TRAIL组均可抑制Jurkat T细胞增殖（q=9．211，12．879；P〈0．01）。④CRT通过与胞外TRAIL结合抑制其介导的早期凋亡：分别加入不同浓度的CRT（4、8、16ng／m1）与100ng／ml TRAIL共同作用后早期凋亡的细胞分别为（30．7±1．1）％、（24．5±1．1）％和（22．3±1．5）％，与对照组（32．4±1．4）％相比差异均有统计学意义（q=3．82，12．17，15．39；P〈0．05）。结论CRT在RA滑液及滑膜组织中呈现高表达，且在RA滑膜组织炎性细胞内外均有表达；CRT可能通过与TRAIL结合抑制其介导的RA中T细胞凋亡进而参与RA炎症反应。

血清淀粉样蛋白A通过Toll样受体4途径诱导类风湿关节炎中性粒细胞胞外诱捕网形成

目的 研究血清淀粉样蛋白A（SAA）对RA中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成的作用及其分子机制.方法 提取RA与健康志愿者的外周血中性粒细胞,①体外培养,观察SAA诱导NETs形成.②中性粒细胞体外培养,分对照、SAA、SAA＋anti-Toll样受体（TLR）4-Ab、脂多糖、脂多糖＋anti-TLR4-Ab及anti-TLR4-Ab,共6组,分别给予相应刺激,观察NETs形成并计算百分率,荧光染色法检测培养上清中DNA的含量.采用F检验和t检验分别对多组及2组结果进行统计分析.结果 ①提取外周血中性粒细胞纯度在95％以上.显微镜下观察到部分中性粒细胞核向外扩散与中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）共定位的网状结构,即NETs.RA患者组SAA刺激中性粒细胞后形成的NETs明显多于Tris-HCl刺激组（19.1±0.8与7.4±0.5,t=12.30,P〈0.05）.②与SAA组相比,anti-TLR4-Ab预处理后,加入SAA刺激中性粒细胞形成的NETs明显减少（5.7±0.4与14.7±1.1,t=7.825,P〈0.05）.培养上清中DNA荧光强度,SAA组明显高于SAA ＋anti-TLR4-Ab组（18.7±0.7与12.9±0.8,t=5.552,P〈0.05）.上清中DNA浓度,SAA组也明显高于SAA＋anti-TLR4-Ab组[（36.9±1.3） μg/ml和（16.3±0.6） μg/ml,t=14.41,P〈0.05].结论 RA中,SAA可以通过与TLR4受体结合诱导NETs形成.

血清淀粉样蛋白A与类风湿关节炎血管新生的研究进展

RA是一种以慢性、进行性、侵袭性多关节炎为主要表现的自身免疫病，其发病率约为整体人群的0．5％～0．8％。关节滑膜炎和滑膜血管翳的形成是RA主要的病理特征，二者与RA的疾病严重程度密切相关。