MicroRNA-21反义寡核苷酸可以抑制U373MG细胞对替尼泊苷VM-26的耐受性

脑胶质瘤患者对化疗药物的耐受性是亟待解决的问题之一.microRNA参与了肿瘤发生发展的诸多过程.选取目前临床上常用的治疗脑恶性胶质瘤的化疗药物替尼泊苷(teniposide)VM-26和人恶性胶质瘤细胞系U373MG为研究对象,通过反义寡核苷酸技术,应用MTT及细胞生长曲线等方法,发现抑制microRNA-21的功能后,细胞活性明显降低,且可以在一定程度上抑制U373MG细胞对VM-26作用的耐受性,而且这种耐受性的抑制与细胞生长速度关系不大,从而为指导临床用药,探索肿瘤细胞耐受化疗药物的机制提供新的线索.

PIWIL1在不同肿瘤细胞中的差异性表达

PIWI作为AGO蛋白家族的成员,在睾丸中特异表达,在精子形成过程中扮演着重要角色.已有文献报道,PIWIL2也广泛存在于多种肿瘤中,与肿瘤的发生相关.本文旨在确定PIWL1在不同肿瘤细胞中的表达差异性,进而初步探讨PIWIL1的表达差异与肿瘤发生发展的关系.半定量RT-PCR和Western印迹检测多种肿瘤细胞中,PIWIL1在mRNA水平及蛋白水平的表达情况,进一步用免疫组化和免疫荧光检测PIWIL1在细胞中的表达及定位.PIWIL1在多种肿瘤细胞中的表达存在差异,其中一些肿瘤细胞中的表达水平较高,包括卵巢癌,前列腺癌,肝癌,胃癌等细胞.对于肿瘤细胞而言,PIWIL1定位于细胞浆中.因此,PIWIL1在多种肿瘤细胞中的表达差异性可能为肿瘤发生发展的研究提供新的线索.

MicroRNA在六种不同器官肿瘤细胞系中的差异表达

[目的]利用生物芯片技术分析microRNA(miRNA)在六种不同器官肿瘤细胞系中mi-croRNA(miRNA)的表达差异。[方法]将210个(206个miRNA,4个阳性对照)与已知人类和小鼠miRNA互补的序列作为探针,点于玻片上制备寡核苷酸芯片。提取肿瘤细胞(HeLa、MCF-7、A549、HT-29、ES-2、K562)的miRNA,用荧光染料Cy3标记,并与制备好的芯片杂交。用Sca-nArrayTMExpress1.0扫描仪扫描荧光信号,采用ScanArray3.0和Cluster3.0软件分析处理扫描结果。并用Northernblot和RT-PCR方法对芯片检测结果进行验证。[结果]芯片检测到在六种不同器官肿瘤细胞系中,发现115种miRNA存在差异,91种miRNA没有明显差异。其中,miR-21在六种肿瘤细胞表达水平均较高,miR-125b表达水平均较低,let-7在六种细胞系中表达水平较低。miR-17-5p和miR-20a呈集簇表达,在卵巢肿瘤ES-2细胞系中的表达水平高于其它细胞,乳腺肿瘤细胞系MCF-7和宫颈癌细胞系HeLa的miRNA的表达谱聚为一类。[结论]应用生物芯片技术检测细胞中miRNA的表达差异谱是可行的,miRNA可能参与肿瘤的发生发展。

喉癌发生相关特异基因筛选与验证

为了检测喉鳞状细胞癌相关的基因表达变化特征,筛选与喉癌发生相关的特异基因.从3名患者体内分别取正常喉上皮组织和喉鳞状细胞癌组织.应用基因芯片技术进行基因表达差异分析及系统聚类分析,并进行半定量RT-PCR验证部分基因芯片结果.本实验基因芯片包括7267条探针,其中,在3对样本中,表达发生显著差异的基因共有94条,有31条上调,63条下调,并且系统聚类分析将正常和癌组织各分为一类,半定量RT-PCR结果与芯片结果一致.实验表明,细胞的代谢、生长、信号传递相关基因(如RAN、PDCD10、zyxin、TACSTD1等)参与了喉癌的发生、发展,并可能扮演了重要角色.

妊娠糖尿病危险因素病例对照研究

目的 探讨妊娠糖尿病（GDM）的危险因素。方法 采用1：4配比病例对照研究方法。对行孕期健康检查的孕妇以问卷调查的方式收集现病史、孕产史、家族史、个人习惯、社会心理因素、父母情况等，并于首诊及孕24～48周进行体格检查和实验室检查，包括50g葡萄糖激发试验（GCT）和75g口服葡萄糖耐量试验（OGTT）实验等。结果 糖尿病家族史、父母患恶性肿瘤、孕前体质指数（BMI）、首诊腰髋比（WHR）、首诊股围与GDM的发生之间有统计学关联。OR值及其95％CI分别为6．930（1．840～26．105），13．804（1．552～122．75）。4．947（1．274～19．203），5．609（1．492～17．227）和6．269（1．867～21．045）。结论 有糖尿病家族史、父母患恶性肿瘤、孕前BMI〉26、WHR≥0．9、首诊股围〉60cm是GDM发生的危险因素。

递呈乳腺癌细胞MCF-7肿瘤抗原的树突状细胞对T细胞的激活

目的:在体外利用细胞因子的诱导获取树突状细胞(DC),并观察递呈肿瘤抗原后的成熟DC对T细胞的激活作用。方法:健康人外周血单个核细胞(PBMC)在体外用细胞因子诱导获取DC,并经乳腺癌细胞MCF-7肿瘤细胞裂解物体外冲击,再以1∶5的比例将致敏DC与T细胞共同孵育5d并共同作为效应细胞,通过FACS分析T细胞激活前后的表型变化以及MTT试验观察体外特异性肿瘤杀伤效果。结果:DC在细胞因子的诱导下7d后,形态学表现为伸出许多伪足样突起,在摄取抗原后可见内吞样小泡。FACS检测呈现成熟DC的标志,CD40、CD83、CD80、CD86和HLA-DR等高表达。另外,未经成熟DC激活的T淋巴细胞以辅助性T细胞(Th)为主,CD4+52.1%,CD8+仅22.1%;而经成熟DC激活的T淋巴细胞以杀伤性T细胞(Tc)为主,CD4+32.6%,CD8+64.2%。同时,MTT试验证实经递呈MCF-7肿瘤抗原的DC激活了细胞毒性T淋巴细胞(CTL),并对MCF-7具有特异性肿瘤杀伤作用。结论:体外递呈肿瘤抗原MCF-7的成熟DC对T细胞具有激活作用,并产生肿瘤特异性CTL。

筛选调节HBV增殖和HBsAg产生的宿主细胞的miRNA

目的筛选调节乙型肝炎病毒(HBV)增殖和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)产生的宿主细胞的miRNA。方法用328种miRNA的反义链转染HepG2 2.2.15细胞,72 h收获上清,MTS检测细胞的增殖活性,ELISA检测表面抗原和e抗原的表达水平,实时定量PCR检测其中HBV DNA的拷贝数。构建筛选到的miRNA的过表达载体,转染HepG22.2.15细胞,也分别用MTS、ELISA和实时定量PCR进行检测。结果 miR-199a-3pASO、miR-210ASO和miR-185ASO促进了HBsAg产生和HBV增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210、miR-185的过表达,分别抑制了HBsAg的产生和HBV的增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的ASO转染组与对照组相比,分别降低了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的过表达载体转染组与对照组相比,分别增加了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05)。结论在没有对细胞的增殖活性产生影响的情况下,miR-199a-3p、miR-210和miR-185抑制了HBV表面抗原的产生和HBV的增殖,miRNA作为病毒与宿主细胞相互作用中的调节因子,在HBV的生命活动周期中具有重要作用。

microRNA与肿瘤

microRNAs(miRNA)是一类新发现的长度只有18～26nt的小RNA,这类非编码的小RNA分子通过调节基因的表达在生物发育、脂肪代谢、细胞的分化、增殖和凋亡等过程中发挥着重要作用,而且可能广泛参与肿瘤发生和发展。

血清胱抑素C和γ-谷氨酰转移酶在糖尿病早期肾损伤的诊断价值

目的:探讨血清胱抑素C和γ-谷氨酰转移酶联合检测在糖尿病早期肾损伤的诊断价值及两者的相关性。方法:测定2型糖尿病组与正常对照组的血清胱抑素C(CysC)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)、尿素(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)的结果进行两独立样本t检验,将2型糖尿病患者的CysC和γ-GT结果进行相关分析,早期肾损伤的阳性检出率为计数资料采用χ2检验。结果:2型糖尿病组各检测指标高于正常对照组且随病程延长CysC和γ-GT值升高,差异有统计学意义,CysC和γ-GT的检测比常规肾功能检测能够更早发现糖尿病早期肾损伤,差异有统计学意义,CysC和γ-GT在2型糖尿病患者呈正相关。结论:CysC和γ-GT的联合检测在糖尿病早期肾损伤的诊断中优于常规肾功能检测,CysC和γ-GT两者密切相关,且随病程进展检测值升高。

人Argonaute2蛋白多克隆抗体制备及初步应用

目的:制备人Argonaute2(Ago2)的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。方法:用DNAstar软件寻找抗原性高的Ago2序列区域(命名为k-Ago2),构建k-Ago2的表达质粒,转化大肠杆菌并诱导表达。融合蛋白经切胶回收纯化后免疫大白兔制备抗体。以ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性及检测Ago2在细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察Ago2的细胞定位。结果:成功构建表达质粒,继而k-Ago2得以表达与纯化,免疫大白兔后得到Ago2多克隆抗体。ELISA检测抗体效价为1∶19 000,Western blot确定抗体具有高度特异性,并成功地用该抗体检测到Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。结论:Ago2多克隆抗体的成功制备,对RNAi机制的深入研究及其进一步的临床应用均具有重要价值。

新型含悬挂羧基聚乳酸的制备及其血液相容性和细胞粘附性

Biodegradable α-hydroxyl polyesters,such as poly(lactic acid)(PLA)and poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)were investigated as scaffolds for tissue engineering.However,polymeric materials on the basis of lactide are limited in blood vessel engineering due to their poor hydrophilicity and low affinity for the cells.In this study,the functional polylactide with pendant carboxyl(PLMACA)was synthesized,which was expected to improve the blood compatibility and cell adhesion of polyester based on PLA.The structure and composition of PLMACA were confirmed via {}1H NMR spectrum and the compatibilities for blood and cell were stu-{died.} The results show that the PLMACA is hopeful to be used as blood vessel substitute with good HUVEC adhesion and anti-platelet adhesion.

慢病毒介导的甲胎蛋白敲减表达抑制肝癌细胞HepG2的增殖

甲胎蛋白(AFP)是原发性肝癌的标志物.本实验室前期研究表明,AFP的表达与肝癌细胞的增殖及细胞周期相关.为了建立高效稳定的AFPsiRNA细胞导入方法,本研究构建了AFP慢病毒siRNA干涉载体pRNAT-U6.2/AFPsiRNA.并将其转入HEK293细胞后,Western印迹表明,pRNAT-U6.2/AFPsiRNA的干扰效率为88.7%(P<0.05).pRNAT-U6.2/AFPsiRNA与4个包装质粒共同转染293T细胞包装成慢病毒后感染HepG2细胞,感染3 d时GFP的表达量达95%,感染35 d的子代细胞中GFP的表达量仍稳定在85%.GFP表达量的观察显示,慢病毒载体可以高效并稳定表达外源基因.Western印迹结果也显示,HepG2细胞被病毒感染3 d和25 d后,AFP表达水平均有降低,抑制率分别为74.8%和63.4%(P<0.05).克隆形成实验表明,AFP沉默后,细胞克隆形成个数降低63%(P<0.01),表明HepG2细胞增殖能力受到抑制.

特异性人端粒酶催化亚单位基因小干扰RNA对HeLa细胞生长的抑制作用

通过设计并化学合成人端粒酶催化亚单位(hTERT)特异性siRNA,观察其对hTERT表达水平及肿瘤细胞生长的影响。将hTERT-siRNA以脂质体法转染入HeLa细胞,应用RT-PCR、实时定量TRAP、Western印迹、软琼脂克隆形成实验、荷瘤裸鼠肿瘤内注射等方法检测细胞内hTERTmRNA、蛋白质表达水平及对肿瘤细胞生长的影响。RT-PCR、实时定量TRAP和Western印迹的结果显示hTERT-siRNA明显降低了HeLa细胞内hTERT的mRNA及蛋白质表达水平并伴随有端粒酶活性的下降。克隆形成实验表明hTERT-siRNA组的体外肿瘤形成能力受到抑制。荷瘤裸鼠肿瘤内注射hTERT-siRNA使肿瘤平均体积显著小于对照组。TUNEL凋亡检测表明hTERT-siRNA转染组的凋亡率明显高于对照组。研究表明hTERT特异性siRNA可以明显抑制HeLa细胞内hTERT的表达水平,对其生长有明显抑制作用,是一种有前途的肿瘤治疗新方法。

MicroRNAs及其对生长发育调控的研究进展

小分子RNA家族中的一员—microRNA是一段非常短的非编码RNA序列,其对细胞周期及个体发育过程调控等功能的研究工作正处于快速的进展之中。本文对miRNA分子及其对动物生长发育调控的研究进展作一综述。

生物芯片检测细胞中microRNA的表达

目的:制备microRNA(miRNA)检测芯片,检测细胞中miRNA的表达。方法:将210个(206个miRNA,4个阳性对照)与已知人类和小鼠miRNA互补的序列作为探针,点于玻片上制备寡核苷酸芯片;提取肿瘤细胞(HeLa,MCF-7,A549,HT-29,ES-2,K562)的miRNA,用荧光染料Cy3标记,并与制备好的芯片杂交;用ScanArrayTM Express1.0扫描仪扫描荧光信号,采用ScanArray3.0和Cluster3.0软件分析处理扫描结果,并用RT-PCR方法对芯片检测结果进行验证。结果:建立了利用生物芯片检测miRNA表达的方法;发现不同细胞miRNA表达谱各异。结论:应用生物芯片技术检测细胞中miRNA的表达是可行的,可为研究miRNA的生理功能和作用机制奠定基础。

血浆miRNA-372/373在正常献血者和HBV早期感染献血者中的表达差异

目的:研究miRNA-372/373与HBV早期感染的相关性,分析其在HBV早期感染诊断中的潜在应用价值。方法:收集来源于2013年3月至9月天津市内无偿献血者所献血液的血浆标本留样,共54份,分为正常组、酶免单阳组(E单阳组)和酶免核酸双阳组(EN双阳组)。提取此3组共54份血浆标本中的mi RNA-372和miRNA-373,用实时荧光定量PCR方法进行检测。分别比较mi RNA-372和mi RNA-373在3组血浆标本之间的表达差异,并对各组间的mi RNA表达趋势进行统计学分析;同时,对miRNA-372、miRNA-373的相对表达水平分别与核酸检测HBV核酸阳性血浆标本中的HBV DNA拷贝数进行相关性分析。结果:经实时荧光定量PCR检测,与正常献血者相比,miRNA-372、miRNA-373在E单阳组和EN双阳组中均表达上调,其中,mi RNA-372、mi RNA-373在EN双阳组中表达上调更为显著。进一步分析发现,在EN双阳组中,mi RNA-372、miRNA-373均与相应的HBV DNA拷贝数呈正相关性,且与mi RNA-372相比,mi RNA-373与相应的HBV DNA拷贝数的正相关性更为明显。结论:miRNA-372、miRNA-373与HBV早期感染密切相关,提示miRNA-372、miRNA-373在HBV感染的早期诊断中具有潜在价值。

miR-210靶基因HBVSP2的鉴定

目的:构建miR-210的过表达载体,利用双荧光蛋白报告基因分析系统验证miR-210的靶基因HBVSP2。方法:构建含有miR-210前体序列的miR-210的过表达质粒pcDNA3.1(+)/pri-miR-210;选取表达绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pcDNA3/EGFP,将miR-210在HBVSP2上靶位点的一段特异性序列插入该质粒中,构建EGFP报告载体pcDNA3/EGFP-HBVSP2,并与miR-210ASO或者pcDNA3.1(+)/pri-miR-210及表达红色荧光蛋白质(RFP)的pDsRed2-N1共同转染HEK293以及HepG22215细胞,用荧光分光光度计定量检测转染后提取的蛋白样品的荧光值。结果:共同转染pcDNA3/pri-miR-210和pcDNA3/EGFP-HBVSP2质粒后,EGFP/RFP的表达量明显低于pcDNA3和pcDNA3/EGFP-HBVSP2共转染组,差异具有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3/pri-miR-210和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP低于pcDNA3和pcDNA3/EGFP-HBVSP2共转染组(P<0.05)。共转染miR-210ASO和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP的表达量高于共转染LacZ和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组,差异具有统计学意义(P<0.05)。LacZ和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP低于LacZ和pcDNA3/EGFP组(P<0.05)。结论:成功构建miR-210的过表达质粒pcDNA3.1(+)/pri-miR-210和含有miR-210靶位点的pcDNA3/EGFP-HBVSP2,HBVSP2可能是miR-210的直接靶基因。

带有HA标签的HBc蛋白真核表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的构建带有流感病毒血凝素9钛表位标签(HA标签)的乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBc)的表达质粒,为进一步研究HBc蛋白基因的功能奠定实验基础。方法设计并合成扩增HBc蛋白全长的PCR引物,以野生型的HBV质粒pDolTHBV-1为模板,PCR扩增全长的HBc蛋白,大小为563 bp;PCR产物经过EcoRI和XholI酶切后,与线性化的pcDNA3/HA载体连接后转化大肠杆菌,扩增、纯化获得所需质粒,以琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定以及基因测序鉴定其分子质量和插入片段的序列;构建的质粒转染HEK293细胞48 h后,RIPA裂解细胞,West-ern blot检测HBc蛋白表达。结果纯化质粒的相对分子质量为5.9 kb,酶切鉴定结果符合目的条带(563 bp)大小,插入的寡核苷酸序列与野生型HBV基因序列完全相符,表达的融合蛋白大小为28 kDa。结论成功构建了带有HA标签的HBc蛋白的真核表达质粒pcDNA3/HA-HBc蛋白,为进一步研究HBc蛋白的功能奠定了良好的实验基础。

转录因子与顺铂耐药关系的研究进展

顺铂是治疗实体肿瘤的常用药物之一,但肿瘤细胞对顺铂的耐药是目前肿瘤治疗中遇到的一大难题。近年来,随着顺铂耐药分子机制研究的深入,已发现一些转录因子如p53/p73、c-Myc、YB-1等与顺铂耐药相关。本文综述了转录因子与顺铂耐药的研究进展。