MicroRNA在6种肿瘤细胞中的表达差异

目的:利用生物芯片技术分析6种不同器官肿瘤细胞中microRNA(miRNA)的表达差异。方法:将210个与已知人类和小鼠miRNA互补的序列(206个miRNA,4个阳性对照)作为探针,点于玻片上制备寡核苷酸芯片。提取肿瘤细胞HeLa(人宫颈癌上皮细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、A549(人肺腺癌细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、ES-2(人卵巢透明细胞癌)、K562(人慢性髓细胞性白血病细胞)的miRNA,荧光染料Cy3标记,并与制备好的芯片杂交;用ScanArrayTM Express1.0扫描仪扫描荧光信号,采用ScanArray3.0和Cluster3.0软件分析处理扫描结果;Northern blotting和RT-PCR方法对芯片检测结果进行验证。结果:在6种不同器官肿瘤细胞中,检测到115种miRNA存在差异,91种miRNA没有明显差异;其中,miR-21在6种肿瘤细胞表达水平均较高,miR-125b表达水平均较低,let-7不同亚型在6种细胞系中表达水平较低;miR-17-5p和miR-20a呈集簇表达,在卵巢肿瘤ES-2细胞中的表达水平高于其他细胞,乳腺肿瘤细胞系MCF-7和宫颈癌细胞系HeLa的miRNA表达谱聚为一类。Northern blotting检测到miR-17-5p及其前体在K562细胞中均见表达,A549和ES-2细胞中只见较弱的前体表达,MCF-7、HeLa和HT-29中可见明显的前体和较弱的成熟miRNA的表达。RT-PCR检测到miR-17-5p前体在K562细胞中表达水平高于其他几种细胞,在ES-2细胞中的表达量低于K562细胞,同时高于另外4种细胞;miR-21在6种肿瘤细胞中表达水平均较高,在A549细胞中表达最高。结论:应用生物芯片技术检测肿瘤细胞中miRNA的表达差异为进一步探索miRNA与肿瘤间的关系奠定基础。

喉癌发生相关特异基因筛选与验证

为了检测喉鳞状细胞癌相关的基因表达变化特征,筛选与喉癌发生相关的特异基因.从3名患者体内分别取正常喉上皮组织和喉鳞状细胞癌组织.应用基因芯片技术进行基因表达差异分析及系统聚类分析,并进行半定量RT-PCR验证部分基因芯片结果.本实验基因芯片包括7267条探针,其中,在3对样本中,表达发生显著差异的基因共有94条,有31条上调,63条下调,并且系统聚类分析将正常和癌组织各分为一类,半定量RT-PCR结果与芯片结果一致.实验表明,细胞的代谢、生长、信号传递相关基因(如RAN、PDCD10、zyxin、TACSTD1等)参与了喉癌的发生、发展,并可能扮演了重要角色.

妊娠糖尿病危险因素病例对照研究

目的 探讨妊娠糖尿病（GDM）的危险因素。方法 采用1：4配比病例对照研究方法。对行孕期健康检查的孕妇以问卷调查的方式收集现病史、孕产史、家族史、个人习惯、社会心理因素、父母情况等，并于首诊及孕24～48周进行体格检查和实验室检查，包括50g葡萄糖激发试验（GCT）和75g口服葡萄糖耐量试验（OGTT）实验等。结果 糖尿病家族史、父母患恶性肿瘤、孕前体质指数（BMI）、首诊腰髋比（WHR）、首诊股围与GDM的发生之间有统计学关联。OR值及其95％CI分别为6．930（1．840～26．105），13．804（1．552～122．75）。4．947（1．274～19．203），5．609（1．492～17．227）和6．269（1．867～21．045）。结论 有糖尿病家族史、父母患恶性肿瘤、孕前BMI〉26、WHR≥0．9、首诊股围〉60cm是GDM发生的危险因素。

递呈乳腺癌细胞MCF-7肿瘤抗原的树突状细胞对T细胞的激活

目的:在体外利用细胞因子的诱导获取树突状细胞(DC),并观察递呈肿瘤抗原后的成熟DC对T细胞的激活作用。方法:健康人外周血单个核细胞(PBMC)在体外用细胞因子诱导获取DC,并经乳腺癌细胞MCF-7肿瘤细胞裂解物体外冲击,再以1∶5的比例将致敏DC与T细胞共同孵育5d并共同作为效应细胞,通过FACS分析T细胞激活前后的表型变化以及MTT试验观察体外特异性肿瘤杀伤效果。结果:DC在细胞因子的诱导下7d后,形态学表现为伸出许多伪足样突起,在摄取抗原后可见内吞样小泡。FACS检测呈现成熟DC的标志,CD40、CD83、CD80、CD86和HLA-DR等高表达。另外,未经成熟DC激活的T淋巴细胞以辅助性T细胞(Th)为主,CD4+52.1%,CD8+仅22.1%;而经成熟DC激活的T淋巴细胞以杀伤性T细胞(Tc)为主,CD4+32.6%,CD8+64.2%。同时,MTT试验证实经递呈MCF-7肿瘤抗原的DC激活了细胞毒性T淋巴细胞(CTL),并对MCF-7具有特异性肿瘤杀伤作用。结论:体外递呈肿瘤抗原MCF-7的成熟DC对T细胞具有激活作用,并产生肿瘤特异性CTL。

cDNA基因芯片对人胶质瘤组织原发性耐药相关基因的筛查

目的:利用cDNA基因芯片筛查与人脑胶质瘤原发性耐药相关的基因,为获取不同个体胶质瘤化疗药物药敏预报基因提供实验依据。方法:收集符合要求的临床手术切除的人脑胶质瘤组织标本共6例,原代培养肿瘤细胞;由MTT法检测替尼泊苷(teniposide,VM-26)对胶质瘤细胞生长的抑制率,按VM-2645μg/ml(人血药峰浓度)时抑制率>30%为敏感、≤30%为耐药作为标准,将6例组织细胞分为耐药和敏感2组。cDNA芯片检测结合聚类分析方法筛查瘤细胞中与耐药相关的差异表达基因;以半定量RT-PCR法检测瘤细胞中HDAC1基因表达加以验证。结果:根据VM-26对细胞抑制率将6例胶质瘤细胞分为3例VM-26敏感和3例耐药。cDNA芯片结合聚类分析共筛选出有表达差异的基因21个,其中表达上调的基因6个、表达下调的基因15个。将表达差异明显的HDAC1经半定量RT-PCR验证,该基因在6例组织中都有表达,趋势与芯片结果一致。结论:胶质瘤原发性耐药可能与cDNA芯片筛查到的21个基因相关,其确切的耐药机制需要进一步深入研究。

筛选调节HBV增殖和HBsAg产生的宿主细胞的miRNA

目的筛选调节乙型肝炎病毒(HBV)增殖和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)产生的宿主细胞的miRNA。方法用328种miRNA的反义链转染HepG2 2.2.15细胞,72 h收获上清,MTS检测细胞的增殖活性,ELISA检测表面抗原和e抗原的表达水平,实时定量PCR检测其中HBV DNA的拷贝数。构建筛选到的miRNA的过表达载体,转染HepG22.2.15细胞,也分别用MTS、ELISA和实时定量PCR进行检测。结果 miR-199a-3pASO、miR-210ASO和miR-185ASO促进了HBsAg产生和HBV增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210、miR-185的过表达,分别抑制了HBsAg的产生和HBV的增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的ASO转染组与对照组相比,分别降低了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的过表达载体转染组与对照组相比,分别增加了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05)。结论在没有对细胞的增殖活性产生影响的情况下,miR-199a-3p、miR-210和miR-185抑制了HBV表面抗原的产生和HBV的增殖,miRNA作为病毒与宿主细胞相互作用中的调节因子,在HBV的生命活动周期中具有重要作用。

血清胱抑素C和γ-谷氨酰转移酶在糖尿病早期肾损伤的诊断价值

目的:探讨血清胱抑素C和γ-谷氨酰转移酶联合检测在糖尿病早期肾损伤的诊断价值及两者的相关性。方法:测定2型糖尿病组与正常对照组的血清胱抑素C(CysC)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)、尿素(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)的结果进行两独立样本t检验,将2型糖尿病患者的CysC和γ-GT结果进行相关分析,早期肾损伤的阳性检出率为计数资料采用χ2检验。结果:2型糖尿病组各检测指标高于正常对照组且随病程延长CysC和γ-GT值升高,差异有统计学意义,CysC和γ-GT的检测比常规肾功能检测能够更早发现糖尿病早期肾损伤,差异有统计学意义,CysC和γ-GT在2型糖尿病患者呈正相关。结论:CysC和γ-GT的联合检测在糖尿病早期肾损伤的诊断中优于常规肾功能检测,CysC和γ-GT两者密切相关,且随病程进展检测值升高。

胶质瘤耐药细胞株的建立及其继发性耐药相关基因的筛查

目的:构建胶质瘤耐替尼泊苷(teniposide,又称VM-26)细胞株,利用基因芯片筛查该细胞株继发性耐药相关基因并证实其表达。方法:选用人胶质瘤细胞系SHG44为靶细胞,从低剂量起始逐步递增用药量(每4 000个细胞VM-26剂量由0.135 ng至4.5 ng)诱导建立对VM-26耐药的细胞株,绘制亲代细胞系和耐药细胞株增殖曲线比较两者倍增时间,采用细胞毒性实验计算半数抑制浓度(IC_(50))比较两者耐药程度的差异。应用人类cDNA表达谱芯片检测耐药和敏感细胞基因表达谱的变化,筛查出与耐药有关的基因并经半定量RT-PCR验证。结果:经过72代诱导培养,建立了稳定耐药的细胞株SHG44/VM-26,耐药性是亲代细胞的52.6倍;耐药细胞倍增时间明显长于亲代细胞(25.6 vs 48.9 h);cDNA芯片筛选出11个基因表达上调,42个基因表达下调;半定量RT-PCR证实基因MDR1、NGFR、HSP22、CX IX、CDKN3和NADE的表达与基因芯片结果基本一致。结论:成功建立胶质瘤耐替尼泊苷细胞株SHG44/VM-26,该细胞株的继发性耐药与基因MDR1、NGFR、HSP22的高表达和CX IX、CDKN3和NADE的低表达相关。

新型含悬挂羧基聚乳酸的制备及其血液相容性和细胞粘附性

Biodegradable α-hydroxyl polyesters,such as poly(lactic acid)(PLA)and poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)were investigated as scaffolds for tissue engineering.However,polymeric materials on the basis of lactide are limited in blood vessel engineering due to their poor hydrophilicity and low affinity for the cells.In this study,the functional polylactide with pendant carboxyl(PLMACA)was synthesized,which was expected to improve the blood compatibility and cell adhesion of polyester based on PLA.The structure and composition of PLMACA were confirmed via {}1H NMR spectrum and the compatibilities for blood and cell were stu-{died.} The results show that the PLMACA is hopeful to be used as blood vessel substitute with good HUVEC adhesion and anti-platelet adhesion.

特异性人端粒酶催化亚单位基因小干扰RNA对HeLa细胞生长的抑制作用

通过设计并化学合成人端粒酶催化亚单位(hTERT)特异性siRNA,观察其对hTERT表达水平及肿瘤细胞生长的影响。将hTERT-siRNA以脂质体法转染入HeLa细胞,应用RT-PCR、实时定量TRAP、Western印迹、软琼脂克隆形成实验、荷瘤裸鼠肿瘤内注射等方法检测细胞内hTERTmRNA、蛋白质表达水平及对肿瘤细胞生长的影响。RT-PCR、实时定量TRAP和Western印迹的结果显示hTERT-siRNA明显降低了HeLa细胞内hTERT的mRNA及蛋白质表达水平并伴随有端粒酶活性的下降。克隆形成实验表明hTERT-siRNA组的体外肿瘤形成能力受到抑制。荷瘤裸鼠肿瘤内注射hTERT-siRNA使肿瘤平均体积显著小于对照组。TUNEL凋亡检测表明hTERT-siRNA转染组的凋亡率明显高于对照组。研究表明hTERT特异性siRNA可以明显抑制HeLa细胞内hTERT的表达水平,对其生长有明显抑制作用,是一种有前途的肿瘤治疗新方法。

MicroRNAs及其对生长发育调控的研究进展

小分子RNA家族中的一员—microRNA是一段非常短的非编码RNA序列,其对细胞周期及个体发育过程调控等功能的研究工作正处于快速的进展之中。本文对miRNA分子及其对动物生长发育调控的研究进展作一综述。

血浆miRNA-372/373在正常献血者和HBV早期感染献血者中的表达差异

目的:研究miRNA-372/373与HBV早期感染的相关性,分析其在HBV早期感染诊断中的潜在应用价值。方法:收集来源于2013年3月至9月天津市内无偿献血者所献血液的血浆标本留样,共54份,分为正常组、酶免单阳组(E单阳组)和酶免核酸双阳组(EN双阳组)。提取此3组共54份血浆标本中的mi RNA-372和miRNA-373,用实时荧光定量PCR方法进行检测。分别比较mi RNA-372和mi RNA-373在3组血浆标本之间的表达差异,并对各组间的mi RNA表达趋势进行统计学分析;同时,对miRNA-372、miRNA-373的相对表达水平分别与核酸检测HBV核酸阳性血浆标本中的HBV DNA拷贝数进行相关性分析。结果:经实时荧光定量PCR检测,与正常献血者相比,miRNA-372、miRNA-373在E单阳组和EN双阳组中均表达上调,其中,mi RNA-372、mi RNA-373在EN双阳组中表达上调更为显著。进一步分析发现,在EN双阳组中,mi RNA-372、miRNA-373均与相应的HBV DNA拷贝数呈正相关性,且与mi RNA-372相比,mi RNA-373与相应的HBV DNA拷贝数的正相关性更为明显。结论:miRNA-372、miRNA-373与HBV早期感染密切相关,提示miRNA-372、miRNA-373在HBV感染的早期诊断中具有潜在价值。

miR-210靶基因HBVSP2的鉴定

目的:构建miR-210的过表达载体,利用双荧光蛋白报告基因分析系统验证miR-210的靶基因HBVSP2。方法:构建含有miR-210前体序列的miR-210的过表达质粒pcDNA3.1(+)/pri-miR-210;选取表达绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pcDNA3/EGFP,将miR-210在HBVSP2上靶位点的一段特异性序列插入该质粒中,构建EGFP报告载体pcDNA3/EGFP-HBVSP2,并与miR-210ASO或者pcDNA3.1(+)/pri-miR-210及表达红色荧光蛋白质(RFP)的pDsRed2-N1共同转染HEK293以及HepG22215细胞,用荧光分光光度计定量检测转染后提取的蛋白样品的荧光值。结果:共同转染pcDNA3/pri-miR-210和pcDNA3/EGFP-HBVSP2质粒后,EGFP/RFP的表达量明显低于pcDNA3和pcDNA3/EGFP-HBVSP2共转染组,差异具有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3/pri-miR-210和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP低于pcDNA3和pcDNA3/EGFP-HBVSP2共转染组(P<0.05)。共转染miR-210ASO和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP的表达量高于共转染LacZ和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组,差异具有统计学意义(P<0.05)。LacZ和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP低于LacZ和pcDNA3/EGFP组(P<0.05)。结论:成功构建miR-210的过表达质粒pcDNA3.1(+)/pri-miR-210和含有miR-210靶位点的pcDNA3/EGFP-HBVSP2,HBVSP2可能是miR-210的直接靶基因。

带有HA标签的HBc蛋白真核表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的构建带有流感病毒血凝素9钛表位标签(HA标签)的乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBc)的表达质粒,为进一步研究HBc蛋白基因的功能奠定实验基础。方法设计并合成扩增HBc蛋白全长的PCR引物,以野生型的HBV质粒pDolTHBV-1为模板,PCR扩增全长的HBc蛋白,大小为563 bp;PCR产物经过EcoRI和XholI酶切后,与线性化的pcDNA3/HA载体连接后转化大肠杆菌,扩增、纯化获得所需质粒,以琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定以及基因测序鉴定其分子质量和插入片段的序列;构建的质粒转染HEK293细胞48 h后,RIPA裂解细胞,West-ern blot检测HBc蛋白表达。结果纯化质粒的相对分子质量为5.9 kb,酶切鉴定结果符合目的条带(563 bp)大小,插入的寡核苷酸序列与野生型HBV基因序列完全相符,表达的融合蛋白大小为28 kDa。结论成功构建了带有HA标签的HBc蛋白的真核表达质粒pcDNA3/HA-HBc蛋白,为进一步研究HBc蛋白的功能奠定了良好的实验基础。

转录因子与顺铂耐药关系的研究进展

顺铂是治疗实体肿瘤的常用药物之一,但肿瘤细胞对顺铂的耐药是目前肿瘤治疗中遇到的一大难题。近年来,随着顺铂耐药分子机制研究的深入,已发现一些转录因子如p53/p73、c-Myc、YB-1等与顺铂耐药相关。本文综述了转录因子与顺铂耐药的研究进展。

胃癌组织中EBV感染与患者年龄以及癌组织类型的关系

目的：调查唐山地区胃癌组织中EBV的感染状况,以分析EB病毒相关胃癌（GC）的临床流行病学特征,以及分析EB病毒在不同年龄以及不同组织学类型胃癌形成过程中的作用。方法：选择胃癌患者手术切除后经石蜡包埋的组织标本共202例。标本经切片和常规脱蜡处理后提取DNA,首先经PCR进行β-actin DNA检测,阳性标本用PCR法检测EBNA1（EB病毒核抗原1）DNA。结果：202份标本β-actin DNA阳性166例,阳性率为82%;166例标本中EBNA1PCR阳性例数为14例,阳性率为8.4%;166例β-actin DNA阳性的胃癌标本中,腺癌150例,经EBNA1PCR检测EB病毒DNA阳性例数在腺癌为14,阳性率为9.3%;150例胃腺癌中,≤45岁15例,46~65岁93例,≥66岁42例,经EBNA1PCR检测EB病毒DNA阳性例数分别为1、9、4例,阳性率分别为6.7%、9.7%、9.5%,差异无统计学意义。结论：EB病毒感染胃癌形成过程中所起的作用与患者年龄无关,而且与癌组织类型无关。

IKKα-siRNA可抑制SKOV3细胞的生长

目的研究IKKα在卵巢癌组织中的表达情况及其对卵巢癌细胞生长增殖能力的影响,探讨IKKα在卵巢癌细胞发生发展中的作用。方法采用实时定量PCR方法检测人卵巢癌组织中IKKα的表达水平,设计并合成针对IKKα的siRNA,利用脂质体转染法将其转入人卵巢癌细胞SKOV3中,通过MTT和平板克隆形成实验观察IKKα-siRNA对SKOV3细胞生长活性和增殖能力的影响。结果实时定量PCR结果显示,IKKα在卵巢癌组织中的表达水平明显高于正常卵巢组织(P<0.05)。MTT和平板克隆形成实验表明,转染IKKα-siRNA的SKOV3细胞的生长活性和集落形成率明显低于对照组(P<0.05或P<0.01)。结论 IKKα在卵巢癌组织中的表达水平显著上升,IKKα-siRNA可抑制SKOV3细胞的生长活性和增殖能力,提示IKKα可能与卵巢癌的恶性发生、发展进程相关。

RNAi在小鼠卵母细胞和胚胎发育研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)介导的、序列特异地引起转录后基因沉默的现象,是生物体内抵御转座子和病毒感染的重要保护机制之一,也是在生长发育过程中调节内源基因表达的重要途径。RNAi可作为一种简单有效的代替基因剔除的工具应用于功能基因组学和疾病的基因治疗研究。现综述RNAi机制、作用特征及RNAi相关技术在小鼠卵母细胞和胚胎发育研究中的应用。