结膜下注射间充质干细胞对大鼠角膜移植物生存的影响

背景 间充质干细胞（MSCs）已用于多种器官移植抗排斥反应的基础和临床研究.我们先前的研究表明,鼠尾静脉注射MSCs可延长大鼠角膜植片的存活时间,但治疗时MSCs的需求量较大且存在一定的全身不良反应.眼局部应用MSCs是否能够替代角膜移植排斥反应的全身治疗尚不清楚. 目的 探讨结膜下注射骨髓MSCs对大鼠角膜移植排斥反应的作用.方法 从清洁级Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓中分离获得MSCs进行培养和传代,以体外成骨细胞分化和脂肪细胞分化法进行鉴定,取第3代MSCs用于实验.将20只Wistar大鼠双眼角膜作为角膜供体植片,40只Lewis大鼠右眼作为受体植床,行同种异体穿透角膜移植术.应用随机数字表法将40只受体大鼠分为PBS对照组和MSCs治疗组,另取6只正常Lewis大鼠作为正常对照组.MSCs治疗组大鼠分别于角膜移植术后即刻和第3天结膜下注射含2＆#215;106 MSCs的PBS 0.1 ml,PBS对照组大鼠以同样的方法仅给予等容积PBS.各组大鼠术后每天裂隙灯显微镜下观察角膜植片的混浊、水肿和新生血管情况,并按角膜植片排斥反应标准进行评分.于术后第10天分别处死PBS对照组和MSCs治疗组各12只大鼠,取出术眼角膜组织,采用实时荧光定量PCR法检测Th1细胞相关炎性因子γ干扰素（IFN-γ）mRNA和白细胞介素-2（IL-2）mRNA及Th2细胞相关炎性因子IL-4 mRNA和IL-10 mRNA在角膜中的相对表达量;采用ELISA法检测角膜组织中Th2细胞相关因子IL-4和IL-10蛋白的质量浓度. 结果 培养的细胞生长良好,成骨细胞分化的细胞茜素红染色呈橘黄色,脂肪细胞分化的细胞油红O染色呈红色,证实为MSCs.角膜移植术后MSCs治疗组角膜植片存活时间为（11.8±1.6）d,长于PBS对照组的（9.6±1.4）d,差异有统计学意义（P=0.004）;MSCs治疗组大鼠角膜植片中IFN-γmRNA、IL-2 mRNA的相对表达量较PBS对照组下降,但2个组间差异均无统计学意义（均P＞0.05）,但IL-4 mRNA和IL-10 mRNA相对表达量明显高于PBS对照组,差异均有统计学意义（均P=0.00）.正常对照组、PBS对照组和MSCs治疗组大鼠角膜植片中IL-10蛋白质量浓度分别为（22.74±7.06）、（68.40±12.83）和（215.41±44.66） pg/ml,3个组间总体比较差异有统计学意义（F=55.06,P=0.00）,且MSCs治疗组大鼠植片中IL-10蛋白质量浓度明显高于PBS对照组及正常对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.结论 结膜下注射MSCs可以延长大鼠异体穿透角膜移植术后植片的存活时间,这一作用可能是通过调节Th 1/Th2平衡,特别是上调Th2细胞因子而介导的.

α-黑素细胞刺激素对谷氨酸诱导的视网膜兴奋性毒性的保护作用

背景 视网膜中谷氨酸异常增高是主要致盲性眼病的基本病理机制之一,但目前仍缺乏一种针对谷氨酸诱导的视网膜兴奋性毒性的有效保护措施.研究证明腹腔注射α-黑素细胞刺激素（α-MSH）可拮抗谷氨酸诱导的大脑海马区神经元的凋亡,但其对视网膜疾病的保护作用尚未证实. 目的 研究α-MSH对谷氨酸引起的视网膜兴奋性毒性的保护作用. 方法 用胚胎第9天（E9）的鸡视网膜建立组织块培养体系.分别收集体外培养第3、5、7天的视网膜组织块及第12、14、16天（E12、E14、E16）的鸡胚视网膜各3块,进行常规苏木精-伊红染色,观察各标本的视网膜形态及组织结构,并用real-time PCR法分别检测不同培养时间点视网膜组织块中α-MSH受体（MCRs）表达量的动态变化.将视网膜组织块分为谷氨酸刺激组、α-MSH＋谷氨酸刺激组以及正常培养组,分别用谷氨酸及α-MSH＋谷氨酸处理48 h,正常培养组未做处理,用TUNEL染色法检测各组视网膜组织块中细胞凋亡情况,并进行定量分析；real-time PCR法检测各组视网膜组织块中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达. 结果 培养3、5、7d视网膜组织块中各层组织结构与E12、E14和E16的视网膜组织结构相似.MC1R mRNA在E9、E12、E14和E16鸡视网膜中的表达量明显低于出生后第1天（P1）,差异均有统计学意义（均P=0.000）；MC5R mRNA在E9的表达量明显低于E12及E14,差异均有统计学意义（均P=0.000）,从E14至P1则逐渐降低；而MC1R mRNA和MC5R mRNA在培养不同时间视网膜组织块中的表达呈现同样的规律.TUNEL染色显示,谷氨酸刺激鸡胚视网膜组织48 h后,视网膜内核层和神经节细胞层细胞大量凋亡,外核层亦有少量凋亡细胞.DAPI染色结果表明,视网膜各层排列紊乱,但α-MSH＋谷氨酸刺激组视网膜结构比较规则.定量分析结果表明,谷氨酸刺激组鸡胚视网膜每张切片的平均凋亡细胞数量为（601±24）个,α-MSH＋谷氨酸刺激组为（62±16）个,正常对照组为（72±13）个,各组凋亡细胞数量总体比较差异有统计学意义（F=1422.890,P=0.000）；α-MSH＋谷氨酸刺激组凋亡细胞数量明显少于谷氨酸刺激组,差异有统计学意义（P=0.000）.谷氨酸刺激组视网膜组织块中GFAP mRNA的相对表达量为2.23±0.06,α-MSH＋谷氨酸刺激组为1.14±0.15,正常对照组为1.05±0.04,组间总体差异有统计学意义（F=82.216,P=0.000）.谷氨酸刺激组GFAP mRNA的表达量是正常对照组的2.1倍,差异有统计学意义（P=0.000）.α-MSH＋谷氨酸刺激组的GFAP的表达量较谷氨酸刺激组显著下调,差异有统计学意义（P=0.000）,但与正常对照组相比差异无统计学意义（P=0.553）. 结论 α-MSH在视网膜组织块中大幅度降低谷氨酸诱导的兴奋性毒性,这种保护作用可能是通过抑制谷氨酸诱导的胶质细胞反应性增生而引起的.