单分子成像显示视网膜血管内皮细胞膜上血管内皮生长因子受体2聚集状态

目的观察单个视网膜血管内皮细胞膜上血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的聚集状态。方法将猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A)分为空白对照组(正常培养)、质粒转染组[转染VEGFR2-绿色荧光蛋白(GFP)重组质粒]。采用共聚焦显微镜观察质粒转染组GFP的表达;实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中VEGFR2的mRNA和蛋白表达情况;单分子成像技术记录细胞膜上表达的单个VEGFR2-GFP分子的荧光强度分布和漂白步数,判断受体的寡聚或多聚状态。结果共聚焦显微镜观察发现,转染12 h后,质粒转染组细胞可见GFP绿色荧光。qPCR检测结果显示,质粒转染组细胞中VEGFR2、GFP mRNA表达较空白对照组显著升高,差异均有统计学意义(t=11.240、12.330,P<0.001、0.001)。Western blot检测结果显示,质粒转染组细胞VEGFR2蛋白表达较空白对照组增强,差异有统计学意义(t=8.346,P<0.01)。单分子成像结果显示,无配体刺激时RF/6A细胞膜表面上VEGFR2-GFP的荧光强度分布为双峰,其中单体、二聚体比例分别为86.0%、14.0%;通过计数GFP荧光漂白步数,静息状态下受体单体、二聚体、三聚体和四聚体比例分别为81.4%、12.9%、5.5%、0.3%。结论无配体状态下,VEGFR2在RF/6A细胞膜表面以单体和包括二聚体在内的多聚体形式共存,以单体为主。