沉默SOCS1共表达HMGB1及肿瘤相关抗原质粒构建

目的:构建沉默细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)并共表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)及肿瘤相关抗原的质粒。方法:首先PCR扩增带有胰岛素信号肽序列的IRES片段和带有胰岛素信号肽序列的HMGB1片段,PCR拼接后取代IRES及EGFP片段装入pIRES-EGFP载体中构建pIRES/sig-HMGB1质粒。然后PCR扩增带有NY-ESO-1编码序列及MAGE3(表位)编码序列亚克隆入pIRES/sig-HMGB1中后以此为模板扩增CMV+NY-ESO-1-MAGE3(表位)-IRES+胰岛素信号肽-HMGB1片段。最后合成针对SOCS1的shRNA序列并连接入pENTR/U6载体,扩增U6-shSOCS1片段与CMV+NY-ESO-1-MAGE3(表位)-IRES+胰岛素信号肽-HMGB1片段连接后装入pIRES-EGFP中,完成p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1质粒的构建并测序,酶切和PCR验证质粒。结果:经测序证实所构建质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒结构正确。结论:成功构建可用于修饰DC疫苗的p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1质粒,为构建新型DC疫苗奠定了基础。

Vav1在吲哚胺2,3双加氧酶抑制T细胞中的作用初探

目的:探讨吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)抑制T细胞中信号传导分子Vav1的分子机制。方法:应用稳定表达IDO的CHO细胞株,与纯化的外周血T细胞共孵育,检测IDO抑制T细胞增殖,诱导凋亡的情况,通过semi-quantitative RT-PCR检测T细胞中Vav1、IL-2 mRNA表达变化;Western blot及免疫沉淀技术检测Vav1蛋白表达及活化情况。结果:IDO可抑制T细胞的增殖。T细胞中Vav1和IL-2 mRNA水平明显下降(P<0.05)。而且,IDO还能使Vav1蛋白的表达和磷酸化水平降低。结论:研究证实在肿瘤局部产生于抗原呈递细胞或肿瘤细胞的IDO,可能通过抑制细胞内重要的信号传导蛋白Vav1的表达和磷酸化过程,使肿瘤浸润淋巴细胞的主动免疫受损,有利于肿瘤发生免疫逃逸。

利用基因表达谱筛选肝细胞癌中炎性微环境形成相关新基因的研究

目的:利用基因表达谱芯片筛选肝细胞癌(HCC)中的差异表达基因,并分析神经降压素(NTS)表达与HCC中炎性微环境形成的相互关系。方法:收集10例原发性HCC癌与癌旁组织,提取RNA进行Affvmetrix全基因组表达谱芯片检测,同时整合GEO数据库中同芯片平台的亚洲人原发性HCC的mRNA表达谱数据30例,利用R2.9.0软件获得差异基因列表,应用Metacore2.5,Pathway studio6.0和Ingenuity1.0软件进行信号通路分析。最后,结合HE染色比较不同NTS表达水平的HCC标本中炎症反应强度。结果:所有RNA样品无降解,各芯片数据的信号强度分布均一。SMA聚类和信号通路分析结果显示40例HCC标本中存在一组独特亚群,呈现神经降压素(NTS)高表达,并伴有胞外间质重构、细胞粘附、白细胞移动、血管新生等生物学过程显著增强。HE染色证实NTS高表达标本中炎细胞浸润、纤维增生和血管生成明显高于NTS低表达的标本。结论:NTS高表达可能促进HCC中炎性环境的形成。

iASPP真核表达载体的构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响

目的:构建iASPP真核表达载体,稳定转染小鼠成纤维细胞(NIH3T3)并检测其表达,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。方法:设计引物以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增其中的CDS区,亚克隆入FLAG-pcDNA3.0,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选28 d,RT-PCR、West-ern blotting检测基因、蛋白表达;MTT法观察细胞增殖能力。结果:重组质粒鉴定正确,筛选所得阳性克隆中可以检测到iASPP基因的转录和表达,且该iASPP阳性表达细胞株增殖能力明显增强。结论:成功构建iASPP真核表达载体并成功构建稳定表达iASPP的NIH3T3细胞株,证明该基因的稳定表达在体外能显著增强NIH3T3细胞增殖能力。

抗ABL胞内抗体对K562细胞酪氨酸激酶活性的影响

目的:观察人慢性粒细胞白血病(CML)细胞转导抗ABL胞内抗体基因后,对其酪氨酸激酶活性的影响。方法:构建逆转录病毒载体MSCV-ib-IRES-eGFP,转导K562细胞,分选eGFP+的细胞,用RT-PCR检测胞内抗体mRNA的表达,观察细胞内BCR/ABL、c-ABL酪氨酸激酶活性及细胞总蛋白酪氨酸激酶活性的变化。结果:获得表达胞内抗体的K562细胞:K562-ib-eGFP。RT-PCR证实胞内抗体mRNA在K562-ib-eGFP细胞内表达。与对照组相比,K562-ib-eGFP细胞内BCR/ABL和c-ABL蛋白酪氨酸激酶活性及总蛋白酪氨酸激酶活性明显受抑制。结论:转导抗ABL胞内抗体能有效降低CML细胞内ABL酪氨酸激酶活性,为进一步研究打下基础。

抗ABL酪氨酸激酶区胞内抗体抑制K562细胞体外生长

目的:观察人慢性粒细胞白血病细胞转导抗ABL酪氨酸激酶区胞内抗体基因后,对其体外生长的影响。方法:通过表达抗ABL蛋白酪氨酸激酶区胞内抗体的模型:K562-ibE-eGFP细胞,观察该细胞与对照细胞在有血清培养条件下的细胞生长和无血清培养条件下细胞活力,并观察无血清培养24h细胞形态学变化。结果:与对照组相比,K562-ibE-eGFP细胞在有血清培养条件下生长受抑制,在无血清培养条件下细胞活力显著下降,并且无血清培养24h细胞出现早期凋亡形态变化。结论:通过转导抗ABL酪氨酸激酶区胞内抗体的方法能抑制慢性粒细胞白血病细胞体外生长,并促进其在无血清条件诱导下凋亡,这可能是细胞内酪氨酸激酶活性降低,BCR/ABL信号途径被阻断,逆转了BCR/ABL对细胞生长和凋亡的影响作用。

新型树突状细胞疫苗的构建及功能的初步鉴定

目的:构建可同时实现沉默细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)刺激和肿瘤相关抗原负载的新型树突状细胞(DC)疫苗。方法:构建沉默SOCS1并共表达HMGB1及肿瘤相关抗原NY-ESO-1的质粒(p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1)。体外诱导单核细胞分化为DC,将p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染入DC细胞。同时设立未转染组、shNC/GFP转染组和p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组。PCR和Western blot验证基因及蛋白表达后,酶联免疫吸附(ELISA)法检测DC细胞分泌的肿瘤坏子因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-12、IL-1及IL-6的变化。结果:经测序证实所构建质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒结构正确。成功将p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染入DC细胞,并在基因和蛋白水平验证NY-ESO-1的正确表达,HMGB1可在胞浆内表达。SOCS1 shRNA质粒shS可沉默SOCS1表达。p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组DCTNF-α、IL-12、IL-1及IL-6分泌量较未转染组和shNC/GFP转染组升高(P<0.05)。结论:成功构建可同时实现沉默SOCS1、HMGB1刺激和肿瘤相关抗原负载的新型DC疫苗。