Aurora激酶抑制剂对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的观察Aurora激酶抑制剂VX-680对人乳腺癌MDA—MB-231细胞株增殖和凋亡的影响。方法不同浓度的VX-680处理MDA—MB-231细胞，倒置显微镜下观察细胞形态变化，用噻唑蓝（M1Tr）比色法和克隆形成实验检测乳腺癌细胞增殖，碘化丙锭（PI）单染法榆测细胞周期，免疫荧光观察核和纺锤体形态变化，免疫印迹法检测AuroraA／B蛋白、组蛋白和凋亡相关蛋白表达，Yo—Pro-1荧光染色观察细胞凋亡形态学变化。结果VX-680显著抑制MDA—MB-231增殖，24、48h半数抑制浓度（Ic50）分别为（2．362±0．599）、（0．102±0．556）μmol／L；经药物作用24h后，贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落；克隆形成率由（93．00±0．03）％降至（0．01±0．01）％，G0／G1期细胞由（51．27±0．75）％降至（5．87±0．49）％，G2／M期细胞由（17．67±1．25）％升高至（91．93±1．96）％，荧光染料法显示凋亡细胞数由（4．33±0．03）％增高至（44．00±0．04）％，实验组与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；细胞核与纺锤体结构紊乱；免疫印迹检测提示磷酸化AuroraA／B、磷酸化Histone H3表达水平降低，Caspase-3和PARP被剪切。结论VX-680抑制乳腺癌细胞MDA—MB-231增殖、诱导凋亡呈剂量依赖性。

芹菜素诱导乳腺癌MCF-7细胞株蛋白激酶B相关性自噬性死亡

目的 探讨芹菜素对乳腺癌MCF-7细胞株增殖的影响及其机制.方法 常规培养MCF-7细胞,用噻唑蓝（MTT）法评价芹菜素（0、10、20、40、80 μmol/L）处理乳腺癌MCF-7细胞株24、48 h的增殖抑制率；DNA ladder检测芹菜素（0、10、20、40 μmol/L）处理24 h对MCF-7细胞株凋亡的影响；、丫啶橙（AO）染色观察芹菜素（0、10、20、40μmol/L）处理24 h后MCF-7细胞自噬泡的形态及数量,然后通过流式细胞术对细胞自噬率进行定量分析；Western blot法检测芹菜素（0、10、20、40 μmol/L）处理24 h后自噬相关蛋白LC3、蛋白激酶B（Akt）及其磷酸化水平的变化；Akt cDNA瞬时转染MCF-7细胞,使其过表达,流式细胞术检测细胞自噬率的变化.结果 MTT显示,芹菜素明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖,具有浓度依赖性及时间依赖性；DNA ladder并未显示出明显的阶梯状条带,提示芹菜素不能有效的诱导MCF-7细胞凋亡；AO染色显示芹菜素可诱导MCF-7细胞株自噬,且流式细胞术显示细胞自噬率具有浓度依赖性,芹菜素20、40 μmol/L组与对照组比较差异有统计学意义（P ＜0.01）；Western blot显示,芹菜素可增加LC3Ⅱ的表达,同时降低Akt的磷酸化水平；自噬抑制剂3-甲基腺苷（3-MA）可使MCF-7的增殖抑制率降低,与对照组比较,差异有统计学意义（P ＜0.05）；Akt cDNA瞬时转染使Akt的表达明显增加,AO染色流式细胞术结果示Akt的过表达使得自噬率降低,与control cDNA转染组比较,差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 芹菜素不能有效地诱导乳腺癌MCF-7细胞株凋亡,而是通过诱导自噬性死亡的方式抑制其增殖,该过程与芹菜素抑制Akt相关通路的活性相关.

SB939诱导乳腺癌细胞周期阻滞和凋亡的作用及机制

目的观察组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂SB939对乳腺癌细胞株T47D和MDA—MB-231增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法不同浓度SB939处理细胞后，用噻唑蓝（MTY）比色法检测对细胞增殖影响；碘化丙锭（PI）染色法检测细胞周期变化；膜联蛋白V（AnnexinV）／PI双染法检测细胞凋亡；Westernblot检测聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）等蛋白表达水平；实时定量聚合酶链反应（ReM-timePCR）检测p21及细胞周期蛋白（Cyclin）B1mRNA水平。结果SB939明显抑制上述两种细胞增殖，24h半数抑制浓度（IC50）分别为（2．721±0．320）、（5．647±0．470）μmoL／L；1μmoL／L药物作用细胞24h，G2／M期比例增加，分别为（21．20±1．90）％、（28．35±2．25）％，凋亡细胞比例增加，分别为（37．60±1．34）％、（34．40±1．77）％，与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；PARP剪切明显增加，bax、p21表达增多，B淋巴细胞／白血病-2（bcl-2）、cdc2、细胞周期蛋白（Cyclin）B1表达减少；p21mRNA水平增加，CyclinB1mRNA水平减少。结论SB939在体外条件下能够明显抑制乳腺癌细胞增殖，诱导细胞周期阻滞及促进细胞凋亡，并呈明显的量效关系。

Aurora激酶抑制剂与BH3模拟剂协同诱导乳腺癌细胞凋亡

目的观察VX-680联合ABT．737对乳腺癌细胞T47D凋亡的影响。方法常规培养T47D细胞，用噻唑蓝（MTT）法检测VX-680联合ABT-737对乳腺癌细胞增殖的影响；Westenblot法检测凋亡指标；免疫荧光染色及流式细胞术观察多核现象；荧光染色观察细胞凋亡形态学变化；流式细胞术检测细胞凋亡率。结果MTF法检测结果显示，VX-680单独用药对细胞抑制作用不明显，半数抑制浓度（IC50）为（25．457±1．406）μmol／L，ABT-737明显降低了VX-680在T47D中的Ic50（0．277±0．057）μmol／L，ABT-737增加VX-680的细胞抑制作用呈剂量关系；ABT737单药对细胞抑制作用不明显，IC50为（0．959±0．018）μmol／L，VX-680与ABT737联合对细胞的抑制作用明显增加，IC50（0．268±0．072）μmol／L；免疫荧光染色结果显示1μmol／LVX-680作用48h出现多核现象；Westernblot检测聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）结果显示，与单独用药比较，VX-680与ABT737联合用药时PARP、Caspase-3剪切明显增加，B细胞淋巴瘤／白血病-2基因（bcl-2）、bcl-xL表达减少、bax表达增加，呈剂量和时间依赖性。流式细胞术显示VX-680联合ABT-737时T47D细胞凋亡率可达（46．40±0．41）％。结论ABT-737可显著提高VX-680对乳腺癌T47D细胞的诱导凋亡作用。

Met抑制剂XL-880对乳腺癌MDA-MB-231细胞的放疗增敏作用

目的研究Met抑制剂XL-880对Met阳性乳腺癌MDA—MB-231细胞系放疗增敏作用。方法依照对细胞不同处理设立对照组、单纯放疗组、XL-880单药组和XL-880联合放疗组。流式细胞术检测不同处理组的细胞早期凋亡率及周期变化，克隆形成试验研究不同处理对肿瘤细胞增殖的影响；Westernblot检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达变化和Met通路相关蛋白表达水平的改变。结果对照组、单纯放疗组、XL-880单药组和XL-880联合放疗组各组克隆数目分别为（41．3±8．2）个、（18．6±2．4）个，（10．6±2．9）个和（0．8±0．2）个，联合组与对照组、单纯放疗组及单药组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。XL-880处理的MDA—MB-231细胞放疗后48h，各组G2／M期细胞所占比例分别为（17．3±1．3）％，（20．0±4．0）％，（28．5±3．1）％，（57．0±3．3）％，G2／M期阻滞增加的差异均有统计学意义（均P〈0．05），AnnexinV／PI双染试验中各组细胞的早期凋亡率分别为（7．3±0．9）％、（14．1±0．6）％、（35．5±4．4）％、（48．2±5．3）％，凋亡率明显升高（均P〈0．05）。XL-880抑制了放疗后细胞Met磷酸化水平，同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP蛋白剪切增加。结论XL-880可通过抑制Met通路进而影响下游CyclinB1水平而对Met阳性乳腺癌细胞系MDA—MB-231产生放疗增敏作用。

成纤维细胞生长因子2逆转上皮间质转化机制

目的探讨成纤维细胞生长因子2（FGF2）逆转转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的肺癌上皮细胞间质转化（EMT）的机制。方法用细胞划痕和Transwell侵袭试验检测细胞运动和侵袭能力变化，用免疫荧光和Western blot法检测逆转过程中关键分子的表达变化。用特异性通路抑制剂分析FGF2逆转EMT发挥作用的的信号通路。结果TGF-β1作用72h后，肺癌上皮细胞发生EMT，细胞运动、侵袭能力增强（200．0±12．5，P〈O．01）。联合FGF2继续培养48h之后，细胞各项指标恢复至对照水平，运动、侵袭能力下降（50．0±5．5，P〈0．01）。利用特异性通路抑制剂LY294002和PD98059后结果显示，抑制丝裂原激活的蛋白激酶／细胞外调节蛋白激酶（MAPK／ERK）通路可以明显阻断FGF2对于TGF-β1诱导EMT的逆转作用，而激活MAPK／ERK通路可以降低TGF-β1对Smad2的磷酸化。结论FGF2通过MAPK／ERK通路逆转TGF-β1诱导的肺痛卜皮细朐EMT．

巨噬细胞及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子促进大鼠腹壁动脉穿支皮瓣存活的作用及其机制

目的探讨巨噬细胞（macrophage）及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM．CSF）促进大鼠腹壁动脉穿支（DEP）皮瓣模型皮瓣存活的作用及分子机制。方法建立大鼠DEP皮瓣模型，分别给与大鼠GM—CSF（Ⅰ组）、腹腔巨噬细胞（Ⅱ组）、GM—CSF联合巨噬细胞（Ⅲ组）及生理盐水（Ⅳ组）。术后第7天取皮瓣，测算皮瓣成活面积、微血管密度（MVD），天狼腥红染色检测胶原沉积，并利用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）法检测I型胶原（CollagenI）、Ⅲ型胶原（CollagenⅢ）、基质金属蛋白酶-2（MMP2）及基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）、血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）的基因表达。结果皮瓣成活率I组（53．08±8．76）％和Ⅱ组（47．95±4．92）％均高于对照组（43．28±5．27）％而低于Ⅲ组（61．68±6．60）％，差异有统计学意义（P〈0．05）。胶原含量I、Ⅲ组（16．34±2．47）％、（19．41±2．01）％均高于对照组（13．19±2．91）％，差异有统计学意义（P均〈0．01）；Ⅱ组（12．50±2．66）％稍低于对照组，差异无统计学意义（P〉0．05）。MVDⅠ-Ⅲ组（24．82±4．18、24．30±3．02、29．82±4．74）均高于Ⅳ组（21．37±2．65），差异有统计学意义，其中Ⅲ组MVD较其他两组MVD更高。I组皮瓣CollagenI、EMMPRIN、MMP2和VEGFR基因表达高于对照组（P〈0．05）；1I组皮瓣EMMPRIN基因表达高于对照组（P〈0．05）；nl组皮瓣CollagenⅠ、CollagenⅢ、EMMPRIN、MMP2和VEGFR基因表达均高于对照组（P〈0．05）。各实验组较对照组VEGF表达差异无统计学意义（P〉0．05）。结论重组大鼠GM—CSF和过继巨噬细胞通过促进皮瓣内胶原合成（CollagenⅠ、CollagenⅢ）及分解（EMMPRIN、MMP2）相关基因的表达，同时促进血管生成相关基因（VEGFR）的表达，促进了皮瓣胶原重塑和血管生成，最终促进了大鼠DEP皮瓣的成活。