CIK细胞中CD4^+T细胞亚群抗肿瘤免疫活性

目的 :观察CIK细胞中CD4 + T细胞亚群抗肿瘤免疫活性。方法 :体外大规模扩增CIK细胞 ,利用磁珠分离系统富集纯化CIK细胞中的CD4 + T细胞亚群。采用胞内染色法分析其中Th1/Th2的比例变化 ;LDH法和荧光染色法比较 4h和 2 0h其对raji细胞的杀伤率和raji凋亡。 结果 :经磁珠分离法富集的CD4 + CIK细胞纯度高达 96 % ,其中Th1/Th2的分布较PBMC有显著的改变 :Th1亚群、Th0亚群明显升高 ,Th2亚群无显著变化。CD4 + CIK细胞虽然不能在 4h之内溶解raji细胞 ,但可在 2 0h时产生同CD4 -CIK细胞同样强大的杀伤活性 ,荧光染色可见其在 4h之内诱导raji出现早期凋亡的迹象。 结论 :本研究提示CD4 + CIK细胞具有明显的“Th1优势”可以调节宿主免疫细胞活性 ;同时CD4 + CIK细胞可通过诱导肿瘤细胞凋亡实现对肿瘤的抑制和杀伤。

肺癌细胞总RNA转染的DC疫苗体外诱导肺癌患者特异性抗肿瘤免疫的实验研究

目的 :为了探讨肺癌细胞总RNA转染的DC疫苗体外诱导特异性抗肿瘤免疫的能力。方法 :采用分离肺癌患者外周血单核细胞体外诱导DC细胞 ,Trizol法提取肺癌细胞系Calu 6总RNA ,用脂质体包裹总RNA转染DC并诱导特异性CTL的扩增 ,LDH法和ELISA法检测CTL的杀伤活性和IFN γ分泌。结果 :经肺癌细胞总RNA转染的DC特异性表面标志及功能相关分子表达均上调 ,转染后的DC可显著刺激异体 自体T淋巴细胞增殖 ,诱导的特异性CTL对携带Calu 6抗原的靶细胞的杀伤率显著高于LAK细胞 ,再次接触相同抗原时其IFN γ分泌量显著增高。结论 :肺癌细胞总RNA转染的DC疫苗可在体外诱导出特异性抗肿瘤免疫。

MUC1粘蛋白在肿瘤免疫治疗中的研究

MUC1粘蛋白存在于正常上皮细胞 ,在多种腺癌中异常表达 ,表现为质和量方面的异常 ,可以非MHC限制性和MHC限制性方式活化细胞毒性T细胞 ,是肿瘤免疫学治疗的理想靶分子 ,可制成不同类型的肿瘤疫苗进行治疗性研究 ,其中部分已进入临床试验阶段 。

CD40/CD40L交联在CD4^+ T细胞诱导肿瘤细胞凋亡中的机制研究

目的:探讨CD40/CD40L交联在CIK细胞中CD4+T细胞(CD4+CIK)诱导肿瘤细胞凋亡中的作用机制。方法:体外扩增CIK细胞并纯化CD4+T细胞亚群,AnnexinV染色法观察CD4+CIK诱导肿瘤细胞凋亡的作用;半定量PCR、流式细胞法及ELISA法比较CD4+CIK激活前后CD40L的表达变化;将转染质粒pIRES2-EGFP-sCD40L的CHO细胞(CHO-sCD40L)与乳腺癌细胞T47D共孵育,监测24小时后其表面分子Fas的表达变化及对Fas介导凋亡的敏感性。结果:CD4+CIK细胞可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡率随孵育时间和效靶比的升高而增加,且肿瘤细胞表面分子Fas水平升高,可从1.98%±0.23%升高到31.62%±7.07%;CD4+CIK细胞被激活后,CD40L表达水平均较激活前明显增加;成功转染的CHO-sCD40L细胞与T47D共培养后,T47D表面分子Fas可被诱导升高,加入CH-1124小时后可观察到明显T47D细胞的凋亡。结论:CD4+CIK可能通过CD40/CD40L交联提升肿瘤细胞表面功能性Fas表达来诱导其凋亡。

吲哚胺2,3-双加氧酶参与乳腺癌患者免疫耐受的研究

目的:研究吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)在乳腺癌组织和引流淋巴结中的表达及调节性T细胞在相应组织内的分布,探讨IDO在乳腺癌免疫耐受中的作用机制。方法:收集26例乳腺癌患者的癌组织、癌旁正常乳腺、引流淋巴结和10例乳腺良性病变组织,用RT-PCR法检测IDO mRNA表达,用免疫组织化学法检测IDO和Foxp3蛋白表达。结果:乳腺癌引流淋巴结中IDO mRNA表达水平及IDO表达阳性指数[(19.59±7.65)%]高于原发乳腺癌组织[IDO表达阳性指数(13.16±7.82)%](P<0.05),乳腺癌组织中IDO mRNA表达水平及IDO表达阳性指数高于乳腺良性病变组织[IDO表达阳性指数(3.24±1.30)%]和癌旁正常乳腺组织[IDO阳性细胞指数(2.70±1.53)%](P均<0.05)。乳腺癌组织中IDO表达水平与肿瘤临床分期和淋巴结转移相关(P<0.05)。乳腺癌引流淋巴结中Foxp3阳性细胞指数[(6.13±2.31)%]高于乳腺原发癌[(3.50±1.04)%],乳腺癌组织中Foxp3阳性细胞指数高于乳腺良性病变[(0.71±0.42)%]和癌旁正常乳腺组织[(0.55±0.34)%](P均<0.05)。乳腺癌和引流淋巴结中IDO的表达水平与Treg细胞的分布间均正性相关(r2=0.449,r2=0.454,P均<0.05)。结论:IDO在乳腺癌细胞中表达增高,并伴随乳腺癌和引流淋巴结中Treg细胞比例升高,提示IDO表达增高有可能通过募集Treg细胞参与肿瘤和引流淋巴结内的免疫耐受。

GM-CSF基因修饰同种异体肺癌细胞疫苗诱导CD8^+ T细胞的免疫反应

目的探讨GM-CSF基因修饰同种异体肿瘤疫苗是否可诱导CD8+ T细胞的特异性免疫反应。方法以接种Lewis肺癌(Lewis Lung Cancer,LLC)细胞株的C57BL小鼠作为动物模型。利用含小鼠粒-巨细胞集落刺激因子(macrophage-colony-stimulating factor,GM-CSF)基因的重组质粒GM-CSF-pIRES2-EGFP,转染小鼠肺癌细胞株LA795,制备同种异体肿瘤疫苗。C57BL小鼠预防接种该疫苗3次后,皮下接种LLC细胞株,分别于免疫前、每次疫苗注射后采集小鼠脾淋巴细胞,采用ELISPOT法检测淋巴细胞经LLC抗原刺激后的活化;脾细胞及其中的CD8+ T细胞对LLC细胞株的杀伤活性;同时采用免疫组化方法检测注射部位淋巴细胞浸润情况。结果疫苗注射部位可见明显的CD8+T细胞浸润;经ELISPOT方法检测,GM-CSF基因修饰LA795疫苗接种后,小鼠脾淋巴细胞经LLC抗原刺激后活化细胞比例均显著升高(P<0.01);同时,脾细胞及其中的CD8+ T细胞对LLC细胞的杀伤活性明显升高(P<0.05)。结论GM-CSF分泌性同种异体瘤苗可诱导CD8+ T细胞的活化,以及对自体肿瘤细胞的杀伤,即可诱导特异性抗肿瘤免疫反应。

应用结肠癌动物模型探讨CIK细胞的抗肿瘤活性和体内分布特点

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞在活体内的分布规律和抗肿瘤活性。方法:以人结肠癌细胞HCT-8接种BALB/C裸鼠建立动物模型。体外培养CIK细胞后以同位素32P-αdATP和荧光染料CM-DiI标记,经尾静脉注射入裸鼠体内。用放射性定量检测方法和荧光显微镜检测方法分析CIK细胞在各器官的动态分布。同时观察肿瘤的体积和重量变化。结果:CIK细胞输入裸鼠体内后,迅速分布至肝、脾、肾、肺、胃、肠等器官,其中肝、脾、肾的分布浓度最高。裸鼠皮下接种结肠癌细胞系HCT-8后,尾静脉注射CIK细胞可以明显抑制皮下移植肿瘤的生长。结论:CIK细胞可以明显抑制肿瘤的生长,同时其体内分布的广泛性表明它可以用于身体各部位恶性肿瘤的治疗。

肿瘤患者循环血管内皮干/祖细胞的检测及体外诱导分化

目的 证实外周血中循环血管内皮细胞 (CECs)及血管内皮前体细胞 (CEPs)的存在 ,检测内皮前体细胞的增殖分化能力。方法 应用流式细胞术检测 5 7例肿瘤患者及 15例正常人外周血中的CECs和CEPs ,应用ELISA方法检测血清VEGF水平。选择经造血干细胞动员的肿瘤患者 ,分离单个核细胞 (MNCs) ,在VEGF、IGF及bFGF条件下培养血管内皮细胞 ,并应用透射电镜法对培养细胞进行鉴定。结果 肿瘤患者外周血中CECs、CEPs含量分别为 0 .3 78%± 0 .0 47%、0 .0 5 9%± 0 .0 13 % ,高于正常对照组 ,且与血清VEGF水平相关。透射电镜下培养细胞可见Weibel-Palade小体 ,为血管内皮细胞的特异性标志。结论 外周血中存在CECs和CEPs ,在肿瘤患者体内存在血管内皮及其前体细胞的动员 ,循环血管内皮干

肿瘤细胞来源胞外体的分离鉴定与功能检测

目的:分离提纯和电镜鉴定乳腺癌细胞系MCF-7细胞分泌的胞外体,并观察其对淋巴细胞增殖的影响。方法:将细胞培养上清进行分步离心、浓缩、密度梯度离心获得纯化后的胞外体,并对胞外体进行透射电镜鉴定。将分离纯化的胞外体加入含有IL-2的淋巴细胞培养体系中,用MTT试验计算淋巴细胞的增殖率,观察胞外体对淋巴细胞增殖的影响。结果:从2×107个细胞可获得20mL纯化的胞外体,测得其总蛋白浓度为(1.84±0.01)g/L,经电镜鉴定MCF-7细胞来源的胞外体直径为55～70nm,为有膜包裹的囊泡状结构,大小较为均一,形态特征与观察到的多泡体的内部囊泡的大小和形态是一致的。MTT试验显示它能够抑制IL-2诱导的淋巴细胞增殖,并且随剂量增加抑制作用增强。结论:肿瘤细胞来源的胞外体可通过细胞培养上清分步离心浓缩纯化得到,其不仅具有胞外体的形态学特征,同时可对IL-2诱导的淋巴细胞增殖产生剂量依赖性的抑制作用。

M2型丙酮酸激酶(PKM2)在肿瘤代谢和发生中的作用

肿瘤细胞即使在氧气充足的情况下也会通过糖酵解方式来进行代谢,消耗大量葡萄糖并最终生成乳酸,这种现象被称为肿瘤的有氧糖酵解,也叫做Warburg效应。在这一过程中存在一个重要的调节因子,即M2型丙酮酸激酶(PKM2),该酶催化其上游底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成丙酮酸。PKM2在增殖的细胞尤其是肿瘤细胞中高表达。PKM2经常在四聚体和二聚体的形式之间变换以决定葡萄糖转化为丙酮酸后是用于供能还是参与生物合成过程。在肿瘤细胞中PKM2通常以二聚体形式存在。EDTA血浆和粪便中的PKM2含量检测可作为一些癌症的诊断标记物。PKM2是一个磷酸酪氨酸(pTyr)结合蛋白,受多种转录因子如HIF1α和一些代谢中间产物如FBP的调节。随着对其调节机制越来越深入的研究,PKM2在肿瘤代谢和发生中的重要作用使它成为临床上肿瘤治疗的一个新靶点,具有广泛的应用前景。

重组MAGE-A1/EGFP质粒转染人树突状细胞体外诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫

目的:应用人重组真核表达载体pMAGE-A1/EGFP转染的树突状细胞(DCs)在体外诱导MAGE-A1特异性T 细胞免疫。方法:构建重组质粒pMAGE-A1/EGFP,体外电转染该质粒入DCs,通过流式细胞仪检测和胞内染色法LDH法比较转染前后DCs在蛋白表达、细胞成熟度和诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫能力的差异。结果:成功构建pMAGE-A1/EGFP 真核表达质粒,电穿孔法导入DCs后观察到MAGE-A1与EPFG实现等效表达,分别为8．8％±0．9％和8．47％±0．78％。 pMAGE-A1/EGFP转染的DCs表面CD86、CD40L和CD83表达水平显著升高,提示DCs的成熟度增加;同时表达的MAGE-A1 蛋白可与小鼠来源抗MAGE-A1的单抗发生特异性结合,并在体外诱导MAGE-A1特异性CD4+T细胞克隆扩增,当再次接触 MAGE-A1抗原时大量分泌IFN-γ。结论:pMAGE-A1/EGFP转染的DCs不仅能在体外诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫,还可通过流式细胞仪进行快速检测,为临床开展MAGE-A1为基础的免疫治疗奠定了一定基础。

MAGE在5种上皮性肿瘤中的表达特点

目的:为探讨MAGE(melanomaantigensgene)肽疫苗在消化系统肿瘤生物治疗的应用前景,本文对消化系统中的5种上皮性肿瘤的MAGE表达进行了检测,并对其分布特点进行了分析。方法:本研究采用RT-PCR法检测了111例消化系统不同肿瘤的MAGE基因的表达。结果:MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3的阳性率分别为7.01%、14.91%、37.71%。48.65%的消化系统上皮性肿瘤表达MAGE-1、-2、-3其中的一种。结论:MAGE家族中以MAGE-3在消化系统上皮性肿瘤的表达最高。

免疫磁性分选系统大量分选CD34^+细胞的实验研究

CD3 4 +细胞的分离纯化在自体外周血干细胞、异基因骨髓移植 /外周血干细胞移植及干细胞研究中具有重要的应用价值。为了摸索大量分选CD3 4 +细胞的方法 ,本研究应用Isolex3 0 0i磁性分选系统富集CD3 4 +细胞 ,采用流式细胞术监测分选前后细胞表面标志 ,经CD3 4 +细胞体外增殖实验及克隆形成实验验证分选获得的CD3 4 +细胞生物学活性。结果显示 ,所完成的 5例次自体外周血富集CD3 4 +细胞时 ,先收获单个核细胞约 ( 3 .5 -6.0 )× 10 10 ,CD3 4 +细胞占单个核细胞百分率为 ( 0 .5 5 - 1.2 ) % ;收获的CD3 4 +阳性细胞总数为 ( 2 - 3 )× 10 8,纯度为 ( 75 - 85 ) % ,回收率为 ( 4 0 - 65 ) %。体外实验表明 ,在SCF +IL 3 +FL +TPO +EPO存在下 ,经过 3 - 4天培养 ,可扩增 2 - 3倍 ;经CFU GM、BFU E集落形成实验显示具有形成集落的能力 ,证实分选后细胞具有造血祖细胞生物活性。结论 :应用Isolex3 0 0iCD3 4 +细胞分选仪可以高效大量富集CD3 4 +细胞 ,适于临床应用。

树突状细胞融合瘤苗体内外诱导特异性抗白血病免疫的实验研究

本研究观察615鼠骨髓来源树突状细胞(DC)与白血病细胞L615融合瘤苗L615/DC体内外诱导特异性抗白血病免疫的能力。分别制备615鼠骨髓来源DC,用PEG融合法将DC与照射灭活的L615制备L615/DC融合瘤苗并免疫动物,用MTT法和LDH法测定L615/DC融合瘤苗免疫鼠脾细胞体外MLR反应和对L615特异性杀伤活性,同时通过免疫治疗实验检测L615/DC融合瘤苗的体内抗白血病作用。结果表明:研究获得了具有特征形态的树突状细胞,MLR反应表现出强大的异基因免疫刺激功能,当L615/DC融合瘤苗免疫鼠的脾细胞再次接触L615抗原时表现出强烈的增殖活性;LDH实验显示,融合瘤苗组、共培瘤苗组和灭活L615组均可在体外诱导扩增出L615特异性CTL,但融合瘤苗组的CTL在不同效靶比、不同孵育时间的特异性杀伤活性均明显高于另两组(P<0.01)。体内免疫治疗实验中L615/DC融合瘤苗治疗组平均寿命为25.7±1天,有1/4小鼠长期存活,而对照组全部死亡,平均寿命17.5±1天。2个月后对治疗组存活鼠用致死剂量L615攻击不发病。结论:L615/DC融合瘤苗可诱导强大的特异性抗L615免疫,它不仅在体外能特异性识别并杀伤L615细胞,还可有效抑制荷瘤鼠体内肿瘤的生长,延长存活时间,并产生免疫记忆,抵抗肿瘤的二次攻击。L615/DC融合瘤苗为肿瘤免疫治疗提供了新的手段。

不同输注途径对CIK细胞治疗后的体内分布的影响

目的探讨经不同途径输注后CIK细胞的体内分布和代谢情况。方法分别以同位素32P-αdATP和荧光染料CM-DiI标记CIK细胞,而后经尾静脉途径和腹腔途径注射入裸鼠体内,用放射性定量检测方法和荧光显微镜检测方法分析CIK细胞在各器官的动态分布。结果CIK细胞输入裸鼠体内后,迅速分布至肝、脾、肾、肺、胃、肠等器官,其中肝、脾、肾的分布浓度最高;CIK细胞输入体内的早期,尾静脉注射途径中肺最先达到分布高峰,而腹腔注射途径中腹腔内器官率先达到分布高峰;CIK细胞在肝、脾的存活可达2周以上。结论CIK细胞体内分布的广泛性表明它可以用于身体各部位恶性肿瘤的治疗;血管输入途径可能更适于血供丰富器官肿瘤的治疗,而体腔输入途径也许更适合于体腔内恶性渗液或局限病灶的治疗。

不同输注途径对CIK细胞体内分布和抑瘤作用的影响

目的研究不同输注途径(皮下、腹腔、瘤周注射)对CIK细胞在活体内的分布规律和抑瘤活性的影响。方法以同位素32P-αdATP标记CIK细胞,而后经尾静脉途径和腹腔途径注射入裸鼠体内,用放射性定量检测方法分析CIK细胞在各器官的动态分布。裸鼠皮下注射结肠癌细胞建立肿瘤活体模型,分别按瘤周、腹腔和尾静脉注射途径接受CIK细胞治疗,观察肿瘤的体积和重量变化。结果CIK细胞输入裸鼠体内后,迅速分布至肝、脾、肾、肺、胃、肠等器官,其中肝、脾、肾的分布浓度最高,CIK细胞在各脏器的分布规律与不同的输注途径存在一定的联系。裸鼠皮下接种结肠癌细胞系HCT-8后,瘤周和尾静脉注射CIK细胞可以明显抑制皮下移植肿瘤的生长,而腹腔注射CIK细胞对于皮下肿瘤的抑制没有统计学意义。结论CIK细胞体内分布的广泛性表明它可以用于身体各部位恶性肿瘤的治疗;针对不同解剖部位的肿瘤可以选择不同的CIK细胞输注途径以最大限度地提高疗效。

肺癌患者中MAGE的表达及临床意义

目的 探讨黑色素瘤抗原基因 (melanomaantigensgene ,MAGE)MAGE A1、MAGE A2和MAGE A3在肺癌中的表达特点并评价其临床意义。方法 采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测 31例肺癌的MAGE表达。结果 MAGE A1、MAGE A2和MAGE A3的阳性率分别为 4 1.94 %、4 5 .16 %和 6 1.2 9%。至少表达 1种MAGE A1～A3的比例达 93.5 5 % ,同时表达 2种MAGE A1～A3的比例达 4 1.94 % ,同时表达 3种MAGE A1～A3的比例是 6 .4 5 %。在不同临床分期、病理分型的标本中MAGE A1～A3表达率差异无显著性。存在淋巴结转移的肺癌标本中MAGE A3表达率明显高于没有淋巴结转移的肺癌标本 ,MAGE A3表达与淋巴结转移显著相关 ,而MAGE A1和MAGE A2的表达与淋巴结转移与否无关。结论 MAGE A1～A3在肺癌标本中有较高的表达率 ,尤其是MAGE A3。MAGE A1～A3表达与肺癌的临床分期、病理分型无关。MAGE A3的表达与肺癌转移存在相关性 。

HSV1-tk基因逆转录病毒载体构建、病毒包装及稳定细胞株建立

目的构建携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,包装后产生携带相应基因的逆转录病毒并稳定感染T47D乳腺癌细胞。方法用PCR方法扩增HSV1-tk基因,利用基因重组技术构建逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,经PCR及BamHI、SalI双酶切鉴定后与gag-pol和env表达载体用脂质体法共同转染293T包装细胞,产生含有HSV1-tk基因的逆转录病毒并用其感染T47D细胞,经G418筛选获得稳定表达株,命名为tk/T47D。结果构建了携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,并通过PCR及BamHI、SalI双酶切证实。包装产生的逆转录病毒提取病毒基因组后PCR扩增出目的基因HSV1-tk,并成功地建立稳定表达HSV1-tk基因的T47D细胞。结论成功的构建了含有HSV1-tk基因的逆转录病毒载体并包装出携带相应基因的逆转录病毒,建立稳定表达HSV1-tk基因的乳腺癌T47D细胞株。