肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。

重组人血管内皮抑制素注射液与多西紫杉醇不同顺序用药的抗肿瘤效应观察

目的 观察重组人血管内皮抑制素注射液（商品名：恩度）与多西紫杉醇联合使用时不同给药顺序的抗肿瘤效应.方法 建立肺腺癌A549荷瘤裸鼠模型,随机分为3组,每组8只.（1）同时用药组：每只小鼠恩度400μg/d,第1～35天;多西紫杉醇10 mg/kg,第1～19天,每3 d给药1次.（2）先恩度组：每只小鼠恩度400 μg/d,第1～35天;多西紫杉醇10 mg/kg,第16～34天,每3 d给药1次.（3）模型组：每只小鼠生理盐水100 μl/d,第1～35天;注射用水200 μl/d,第1～35天,每3 d注射1次.同时设立空白对照组（未荷瘤的正常裸鼠,8只）,注射方法同模型组.实验过程中测量各组裸鼠体重、移植瘤体积,并计算抑瘤率.实验结束后,采用流式细胞术检测裸鼠外周血循环内皮细胞（CECs）数,采用免疫组化法检测移植瘤组织中基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、MMP-2的抑制剂（TIMP-2）、MMP-9的抑制剂（TIMP-1）、细胞外MMP诱导因子（EMMPRIN）、α-平滑肌肌动蛋白（SMA）的表达情况,并计数微血管密度（MVD）.结果 同时用药组肿瘤体积增长为39.94 mm3,先恩度组肿瘤体积增长为（99.57±74.48）mm3,二者均明显小于模型组[（217.67±95.44）mm3,均P＜0.05].同时用药组、先恩度组、模型组和空白对照组裸小鼠外周血中CECs的数量分别为（25.86±11.77）个/104个细胞、（77.25±24.02）个/104个细胞、（14.71±11.07）个/104个细胞和（12.90±11.20）个/104个细胞,同时用药组、模型组和空白对照组均明显低于先恩度组（均P＜0.01）.同时用药组和先恩度组移植瘤组织中MMP-2和MMP-9的表达均较模型组下调（均P＜0.05）,先恩度组移植瘤组织中TIMP-1和同时用药组TIMP-2的表达均较模型组上调（均P＜0.05）,同时用药组EMMPRIN的表达较模型组下调（P＜0.05）.同时用药组和先恩度组移植瘤组织的MVD及α-SMA的水平均低于模型组（均P＜0.05）.结论 同时用药组的抑瘤效果及小鼠生存质量更好.同时用药组和先恩度组均可通过下调MMPs的表达以限制肿瘤进展.CECs的变化可能是先上升后下降的动态过程,早期升高可能提示新生血管床面积减小,继而下降则反映联合治疗后的CECs凋亡和肿瘤消退,动态观察CECs的变化可能有助于了解肿瘤负荷及其血管床的变化并预测疗效.

重组人血管内皮抑制素对小鼠移植瘤及正常组织中血管相关因子影响的比较

目的:观察重组人血管内皮抑制素(rh-endostatin,商品名:恩度,endostar)的抗肿瘤及抗血管生成效应,比较其对移植瘤、心肌及肾脏组织中神经型一氧化氮合成酶(neuron NOS,nNOS)、内皮型一氧化氮合成酶(endothelial NOS,eNOS)mRNA、血管生成因子表达和微血管密度及结构的影响,探讨其对心血管系统不良反应的原因。方法:将36只小鼠随机分为空白对照组(不接种瘤块,注射生理盐水)、药物对照组(不接种瘤块,注射恩度)、模型组(接种瘤块,注射生理盐水)和实验组(接种瘤块,注射恩度),每日1次,处理28天。实验前、后称量小鼠体重,测量移植瘤体积;Real-time PCR法检测各组小鼠移植瘤、心脏及肾脏组织中nNOS、eNOSmRNA的表达量,免疫组化法检测小鼠移植瘤及肾脏组织中基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9、缺氧诱导因子HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况,CD34标记血管内皮细胞计数微血管密度(MVD);以CD34与Masson双色染色法观察微血管结构的变化结果:1)实验组移植瘤体积增长(75.60 mm^3)小于模型组(131.89mm^3),差异有统计学意义(P=0.030);各组小鼠体重变化无显著性差异(P=0.609)。2)药物对照组及实验组小鼠肾脏组织中nNOS及eNOSmRNA表达量均下调(P<0.05),心肌组织中nNOSmRNA表达下调(P<0.05)、eNOSmRNA却未见明显变化;各组小鼠移植瘤组织中nNOS及eNOSmRNA表达的差异均无统计学意义。3)移植瘤组织中MMP-9和VEGF蛋白的表达显著降低,MMP-2、HIF-1α及各组小鼠肾脏组织MMP-2、MMP-9、HIF-1α、VEGF表达无明显变化;移植瘤组织的MVD显著降低,胶原覆盖血管的比例升高,而肾脏组织中MVD和结构几乎无变化。结论:重组人血管内皮抑制素可下调移植瘤组织中MMP-9和VEGF蛋白的表达、降低MVD,抑制移植瘤的生长,并可使移植瘤血管趋向成熟,但不能降低肾脏组织中血管生成相关因子的表达、亦不能改变肾脏组织的MVD及微血管结构;其可下调心脏及肾脏组织NOSmRNA的表达,可能为应用中导致血压变化的原因之一。

193例特殊类型肺腺癌的临床特征及预后分析

目的:分析"细支气管肺泡癌(bronchioloalveolar carcinoma BAC)及具有其特征的混合型腺癌"(2004年分型)的不利预后因素,并经2011年肺腺癌新病理分型验证,确定此类肿瘤的重要预后因素、阐明两种分型在评估临床预后的连贯性。方法:回顾性分析天津医科大学附属肿瘤医院1974年3月至2007年5月收治并经病理学或细胞学确诊且随访资料完整的193例BAC及具其特征的混合型腺癌患者资料,并将其中符合新分型的原位腺癌、微浸润癌与其他类型区别而单独分组,记录性别、年龄、肿瘤大小、有无肿瘤家族史、吸烟史、TNM分期、临床症状持续时间及治疗方法等因素;以Kaplan-Meier法计算生存率、Log-rank进行生存率显著性检验、Cox比例回归风险模型进行单因素、多因素分析,评价各因素对预后的影响。结果:全部患者的1年、3年、5年生存率分别为84.3%、60.6%、45.6%,中位生存期为53个月。单因素分析显示:确诊时临床分期(P<0.001)、出现临床症状(P=0.018)、原发病灶大小(P=0.039)、病理类型(P=0.028)及治疗方法选择(P=0.035)是影响预后的因素;Cox回归多因素分析显示:仅确诊时临床分期是影响预后的独立因素;其中符合新分型中的原位腺癌及微浸润癌患者预后最佳。结论:BAC及具有其特征的混合型腺癌较其他非小细胞肺癌(NSCLC)预后好、临床表现无特异性,确诊时的TNM分期是影响预后的独立因素;在评估临床预后方面,新肺腺癌分型与2004年分型具有连贯性,且更细化、更利于指导临床。

73例肺类癌的临床特征及预后分析

背景与目的类癌在肺部肿瘤中较为少见、对其特点知之较少。本研究拟观察肺类癌(Pulmonary Carcinoid Tumors)的临床特征并分析影响预后的因素。方法回顾性分析天津医科大学附属肿瘤医院1977年1月至2009年3月收治的73例肺类癌临床资料,分别对性别、年龄、吸烟史、肿瘤家族史、组织类型、TNM分期等进行单及多因素预后分析。结果全部患者的1年、3年、5年、及10年生存率分别为89.7%、68.4%、64.1%和55.8%,好于其它类型肺癌。单因素分析显示,吸烟史(P=0.044)、TNM分期(P<0.001)、肿瘤大小(P=0.007)、肿瘤位置(P=0.032)、组织类型(P=0.009)、有无术后辅助治疗(P=0.001)、有无淋巴结转移(P=0.002)和M分期(P=0.001)是影响预后的因素。多因素分析显示,肿瘤大小(P=0.005)、肿瘤位置(P=0.038)和TNM分期(P=0.046)是影响预后的独立因素。结论原发性肺类癌预后好于其他肺癌、确诊主要依靠术后病理诊断,根治性手术是主要治疗手段。影响其预后的独立因素是肿瘤大小、位置及TNM分期。

抗血管生成疗效的评价:新标准还有多远?

抗血管生成治疗是恶性肿瘤的一种新兴疗法,在临床应用中已取得较好的疗效,但如何更准确地动态评价疗效及预测预后是目前所面临的难题。本文就抗血管生成疗效评价的现状、面临的问题及可能的发展方向作一综述。

重组人血管内皮抑素与多西紫杉醇不同顺序用药调控移植瘤组织MMP及抗瘤效应观察

背景与目的通过药物干预性动物实验,观察重组人血管内皮抑素(rh-endostatin)与多西紫杉醇不同顺序联合用药后MMP-2及相关因子的变化及其对移植瘤生长与血管生成的影响,探索两药联合的作用机制和最佳抗肿瘤方案。方法建立肺腺癌A549荷瘤裸鼠模型,分两个阶段进行实验。第一阶段:将荷瘤小鼠随机分为重组人血管内皮抑素组(重组人血管内皮抑素400μg·d-1,d1-d14)和多西紫杉醇组(多西紫杉醇10mg·kg-1·3d-1,d1-d14);第二阶段:将荷瘤小鼠随机分为同时用药组(重组人血管内皮抑素400μg·d-1、d1-d35,多西紫杉醇10mg·kg-1·3d-1、d1-d19)、先重组人血管内皮抑素组(重组人血管内皮抑素400μg·d-1、d1-d35,多西紫杉醇10mg·kg-1·3d-1、d16-d34)和模型组。实验中动态测量移植瘤体积,结束后以免疫组化方法检测MMP-2、TIMP-2、EMMPRIN表达并计数微血管密度(MVD)。结果两单药组比较,重组人血管内皮抑素组MMP-2和EMMPRIN表达下调较多西紫杉醇组(P=0.024,P=0.081)明显,两组间TIMP-2表达无明显差异(P>0.05)。联合组用药结束时,同时用药组与先重组人血管内皮抑素组的移植瘤体积小于模型组(P<0.001,P=0.003),且MMP-2表达均明显下调、微血管数减少(P<0.05),但同时用药组对肿瘤生长的抑制较先重组人血管内皮抑素组明显;与模型组相比,同时用药组TIMP-2上调(P=0.001)、EMMPRIN下调(P=0.018),先重组人血管内皮抑素组未见相似结果。结论同时用药方案可以从TIMP-2、EMMPRIN两个环节下调MMP-2的表达,从而更好地抑制肿瘤生长。

61例肺实性型腺癌的临床特征及预后分析

目的:探讨肺实性型腺癌的临床特征及影响预后的因素方法:回顾性分析1975年7月至2010年4月收治的61例肺实性型腺癌患者的临床资料,其中行手术为主的综合治疗54例、非手术治疗7例分别对性别、年龄、吸烟史、肿瘤部位、肿瘤大小、淋巴结转移、pTNM分期等因素进行预后分析。Kaplan-Meie r法计算生存率,Log-rank法进行生存率显著性检验,Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素分析,评价各因素对预后的影响结果:全部患者的1、3和5年生存率分别为77.3%、44.8%和25.2%。单因素分析显示:肿瘤大小(P<0.001)、有无淋巴结转移(P=0.014)、M分期(P=0.013)、pTNM分期(P=0.006)、治疗方式(P<0.001)和手术方式(P=0.006)是影响预后的因素。多因素分析显示:肿瘤大小(P=0,015)、有无淋巴结转移(P<0.001)、M分期(P=0.013)和治疗方式是影响预后的独立因素。结论:肺实性型腺癌发生率低,缺乏特异性临床表征,较易发生淋巴结转移,预后差影响其预后的因素主要为肿瘤大小、淋巴结转移、M分期和治疗方式根治性手术是其主要治疗手段争取早期正确诊断、选择正确的治疗方法,是提高生存率的方法。

PIM1启动子区基因多态性与非小细胞肺癌易感性的相关性研究

目的:原癌基因PIM1通过活化下游基因,参与细胞增殖、分化及肿瘤形成。本研究旨在探讨中国人群PIM1基因启动子区(-1 882A>T)单核苷酸多态性与非小细胞肺癌易感性的相关性。方法:应用聚合酶链反应-直接测序法检测25例患者及25例正常对照者的PIM1基因启动子区多态性,应用聚合酶链反应-直接测序法检测206例非小细胞肺癌患者以及189例正常对照者-1 882A>T多态性位点的基因型,并进行病例、对照相对危险度分析。结果:等位基因-1 882T在肺癌患者和健康对照者中频率分别为6.8%和11.0%,等位基因分布频率在两组间存在显著性差异(P=0.025)。相对危险度分析显示携带TA+TT基因型者发生非小细胞肺癌的风险明显低于携带AA基因型者(OR=0.568,95%CI=0.335～0.962,P=0.034)。结论:中国人中PIM1基因启动子区单核苷酸多态性(-1 882A>T)与非小细胞肺癌发生可能有关,T等位基因的存在可能降低肺癌发生的风险,可能是发生非小细胞肺癌的保护性因素。

化疗诱导的白细胞减少症可预测小细胞肺癌生存

目的:化疗是小细胞肺癌的标准治疗方式,而白细胞减少症是其常见的不良反应。本文研究旨在评估化疗诱导的白细胞减少症是否可作为预测小细胞肺癌患者疗效及生存的指标。方法:回顾性分析了445例接受4～10个周期标准化疗的小细胞肺癌患者的病例资料,按照WHO标准将白细胞减少症分为无白细胞减少症(0级)、轻度(1～2级)及重度白细胞减少症(3～4级)。主要研究终点为总生存时间。结果:化疗诱导的白细胞减少症与总生存时间之间明显相关,轻度白细胞减少的患者有较长的总生存期。轻度白细胞减少症的死亡危险比为0.687(95%CI:0.506～0.943),而重度白细胞减少症的死亡危险比为0.901(95%CI:0.669～1.214)。无白细胞减少的患者的中位生存时间为13个月、轻度与重度白细胞减少症的中位生存时间分别为17个月和14个月。结论:小细胞肺癌患者化疗过程中诱发的白细胞减少程度与患者生存有关,轻度白细胞减少的患者有较长的总生存时间。

142例肺乳头状腺癌的临床特征及预后分析

目的:观察肺乳头状腺癌(lung papillary adenocarcinoma,LPA)的临床特征及影响预后的因素。方法:回顾性分析天津医科大学附属肿瘤医院1970年9月至2008年11月收治的142例肺乳头状腺癌,分别分析年龄、性别、吸烟史、肿瘤家族史、TNM分期等对预后的影响。Kaplan-Meier法计算生存率,Log-rank法进行生存率显著性检验,Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素分析。结果:临床特征与其他类型腺癌相似,1、3及5年生存率分别为60.0%、34.5%、25%。单因素分析显示性别(P=0.039)、吸烟史(P=0.001)、肿瘤大小(P<0.001)、有无淋巴结转移(P<0.001)、有无远处转移(P<0.001)、pTNM分期(P<0.001)是影响预后的因素;多因素分析显示吸烟史(P<0.001)、肿瘤大小(P=0.003)、有无淋巴结转移(P=0.001)是影响预后的独立因素。结论:肺乳头状腺癌的诊断主要依靠术后病理,缺乏特异性临床表征,吸烟史、肿瘤大小、有无淋巴结转移是影响预后的独立因素。

重组人血管内皮抑制素注射液联合化疗多周期治疗晚期非小细胞肺癌的疗效

目的观察重组人血管内皮抑制素注射液联合TP或NP方案治疗晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的疗效和安全性，并探讨与治疗周期的关系。方法经病理组织学和（或）细胞学检查确诊的25例mb～IV期NSCLC患者，采用重组人血管内皮抑制素注射液联合NP方案治疗21例，联合TP方案治疗4例，21d为1个周期，观察患者的近期疗效、疾病进展时间（TTP）、1年生存率、中位生存时间（OS）、生活质量变化和不良反应。采用流式细胞术检测治疗前、后外周血循环活化血管内皮细胞（aCECs）的数量，并评价其与疗效和治疗周期的关系。结果全组25例患者均可进行疗效和安全性评价，其中部分缓解（PR）5例（20．0％），稳定（SD）14例（56．0％），进展（PD）6例（24．0％），客观有效率（RR）为20．0％，临床受益率（CBR）为76．0％，中位TTP为8个月，中位OS为19个月。短周期治疗（周期〈4个）14例，其中PR2例，SD6例，PD6例，RR为14．3％；临床受益的8例患者的中位TTP为6个月，中位OS为18个月。长周期治疗（周期≥4个）11例，均为临床受益患者，其中PR3例，SD8例，RR为27．3％，中位TTP为17个月，中位OS为26个月。短周期治疗临床受益者aCECs平均上升（293±12）个／10^5，长周期治疗临床受益者平均下降（243±181）个／10^5。治疗周期、TTP均与治疗前、后aCECS的数量变化呈正相关（r=0．970，P=0．001；r=0．829，P=0．042）。全组生活质量改善12例，稳定10例，下降3例。全组患者的常见不良反应为血液和胃肠道不良反应，均不影响继续用药，长周期组和短周期组患者3—4度不良反应的发生率差异无统计学意义。结论重组人血管内皮抑制素注射液联合TP或NP方案治疗晚期NSCLC能显著提高远期疗效，长周期治疗的患者rITrP和OS均较短周期者延长，且长周期治疗并不增加不良反应的发生率。aCECs是较好的预测NSCLC疗效的指标。

大细胞肺癌的临床及预后分析

目的 探讨大细胞肺癌（LCLC）的临床病理特征及预后影响因素.方法 回顾性分析111例LCLC患者的临床资料,采用单因素和多因素分析方法分析预后的影响因素.结果 111例LCLC中,病灶位于右肺53例,其中位于上叶26例 病灶位于左肺58例,其中位于上叶35例.中央型36例,周围型75例.肿瘤平均直径为5.3 cm.Ⅰ期38例,Ⅱ期11例,Ⅲ期45例,Ⅳ期17例.淋巴结转移60例,远处转移17例.111例LCLC患者1、3、5年生存率分别为54.7%、30.9%和20.6%.单因素分析显示,N分期、M分期和TNM分期与患者预后有关（均P=0.000）.多因素分析显示,TNM分期是患者预后的独立影响因素（P=0.000）.结论 LCLC预后较其他非小细胞肺癌差,根治性手术是主要治疗手段,影响其预后的独立因素是TNM分期.