含有生肌液的组织工程皮肤修复兔皮肤缺损

背景:在皮肤开放创面上进行缺损修复与重建是组织修复领域的研究焦点。构建含有中药的组织工程皮肤修复创面缺损的研究并不多见。目的:将含有生肌液的皮肤支架与自体皮肤细胞复合,构建含药组织工程皮肤,修复兔皮肤缺损。设计:自体对照动物实验。单位:实验于2005-02/08在天津市天津医院骨科研究所细胞工程室完成。材料:同窝大耳白兔8只,体质量1.6～1.8kg。自行提取生肌液(1500g/L),成分为当归、生地、龟板、象皮、血余、生石膏、炉甘石;明胶-壳聚糖支架材为料天津大学提供,分别修剪成1.3cm直径的圆片,60Co照射灭菌;DR无细胞真皮基质由江苏省启动市医疗用品研究所提供。方法:分离培养兔皮肤细胞,获取第3代角质形成细胞与成纤维细胞。延兔脊柱两侧制作直径1.5cm的圆形全层皮肤缺损创面4个。分为4组,阴性对照组(明胶-壳聚糖支架贴附于创面后滴加生理盐水),人工真皮组(DR无细胞真皮基质贴附于创面后接种细胞悬液),非含药组织工程皮肤组(明胶-壳聚糖支架贴附于创面后接种细胞悬液),含药组织工程皮肤组(生肌液-明胶-壳聚糖支架贴附于创面后接种细胞悬液)。主要观察指标:①术后13d测量剩余创面面积。②术后7d、10d取材行组织学与免疫组织化学染色检测。结果:①术后13d各组创面面积均有不同程度的缩小,剩余面积阴性对照组>人工真皮组>非含药组织工程皮肤组>含药组织工程皮肤组,非含药组织工程皮肤组、含药组织工程皮肤组与阴性对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)。②术后10d,阴性对照组、人工真皮组、非含药组织工程皮肤组均有炎性肉芽组织增生,无表皮组织形成;含药组织工程皮肤组形成接近正常的上皮组织及幼稚的真皮组织。非含药组织工程皮肤组与人工真皮组BrdU标记弱阳性,含药组织工程皮肤组BrdU标记强阳性。结论:实验采用的方法使种子细胞在含有生肌液的明胶-壳聚糖支架上增殖,在体修复皮肤损伤,能够有效扩展皮肤缺损处的覆盖面积,缩短皮肤缺损的愈合时间。

含有生肌液的明胶-壳聚糖皮肤支架的生物学特性研究

目的利用皮肤种子细胞筛选生肌液应用浓度及探讨生肌液-明胶-壳聚糖载药支架对细胞黏附情况及生物相容性研究。方法应用第3代角质细胞(KC)和成纤维细胞(Fb),配制7种不同培养液(10%FBS MEM,质量浓度5、6、8、12mg/ml生肌液,质量浓度8mg/ml当归提取液,质量浓度8mg/ml生地提取液)进行条件培养,分别于1、3、5、7d用MTT法检测KC和Fb的增殖情况;制备含不同浓度生肌液(50、60、80、120mg/ml)的载药支架,分别于7、14d用半定量方法考察细胞与支架的黏附情况;选择其中2种支架种植KC后,分别于4、7、14d取材,进行HE染色和扫描电镜观察。结果2种细胞MTT检测结果表明,中低浓度生肌液组(5、6、8mg/ml)增殖较快,其中8mg/ml生肌液组与对照组比较差异有统计学意义。2种细胞在中等浓度(60、80mg/ml)载药材料上可获得较快增殖;支架上的KC形态良好,与支架紧密贴附,药物对细胞无明显毒性作用。结论生肌液浓度为60、80mg/ml的明胶-壳聚糖支架可有效地促进KC和Fb的黏附和增殖。

生肌液-明胶-壳聚糖载药皮肤支架的细胞相容性(英文)

背景:组织工程皮肤对于大面积皮肤缺损的修复与重建具有重要作用,含有中药的组织工程皮肤支架对于细胞黏附及创面感染控制的作用研究并不多见。目的:利用角质形成细胞与成纤维细胞筛选生肌液应用浓度,观察生肌液-明胶-壳聚糖载药皮肤支架对细胞黏附及生物相容性影响。设计、时间及地点:以角质形成细胞与成纤维细胞为观察对象,随机对照实验,于2005-02/08在天津市天津医院骨科研究所细胞工程室完成。材料:健康大耳白兔1只,用于获取皮肤种子细胞;生肌液、当归提取液及生地提取液(自行提取,1.5g/mL),明胶-壳聚糖支架及生肌液-明胶-壳聚糖支架由天津大学提供。方法:①以dispaseⅡ-胰蛋白酶-EDTA消化法获取第3代角质形成细胞与成纤维细胞。②实验分为5组,对照组为普通培养液(含体积分数为0.1胎牛血清的基础培养基);生肌液组为含有生肌液质量浓度分别为5,6,8,12g/L的培养液;当归组为含有当归提取液质量浓度为8g/L的培养液;生地组为含有生地提取液质量浓度为8g/L的培养液;表皮生长因子组为含有10μg/L表皮生长因子的培养液;分别用于培养第3代角质形成细胞和成纤维细胞,于1,3,5,7d用MTT法检测细胞的增殖情况。③制备基质中生肌液质量浓度分别为50,60,80,120g/L的载药支架组,将上述细胞在支架上培养,分别于7,14d用半定量方法观察细胞与支架的黏附情况。④60,80g/L载药支架组种植角质形成细胞,分别于4,7,14d取材,进行苏木精-伊红染色和扫描电镜观察。主要观察指标:①生肌液对皮肤种子细胞增殖的影响。②载药支架对细胞黏附的影响。③细胞与载体的相容性。结果:①MTT检测结果表明,5、6、8g/L的生肌液组细胞增殖较快,与对照组相比,差异有显著性意义(P<0.05)。②第3代角质形成细胞与成纤维细胞在60、80g/L的载药支架上可获得较多增殖。③支架上的角质形成细胞形态良好,与支架紧密贴附,药物对细胞无明显毒性作用。结论:生肌液质量浓度为60,80g/L的明胶-壳聚糖载药支架可有效促进角质形成细胞和成纤维细胞的黏附和增殖。

毛囊干细胞的研究进展

【摘要】毛囊干细胞是毛囊组织维持自我更新的基础，它具有干细胞的一般特征，普遍认为定位于毛囊隆突部。毛囊干细胞的标记物是分离和鉴定细胞的重要依据，在多种信号通路调控下可以分化为毛囊、皮脂腺和表皮。至此，毛囊干细胞在组织工程皮肤中的作用引起人们的关注，就毛囊干细胞的研究进展作一阐述。

不同方法诱导兔脂肪干细胞向软骨细胞分化的对比研究

目的 分别用细胞共培法和诱导液培养法诱导脂肪干细胞（adipose-derived stemcells,ADSCs）向软骨细胞分化,比较两种方法的诱导效果.方法 分离培养新西兰大白兔ADSCs和软骨细胞,分别培养至第2代用于实验.根据实验目的将实验分为三组：（1）对照组：将ADSCs接种于6孔板,普通高糖培养液培养;（2）细胞共培组：将软骨细胞和ADSCs分别接种于Transwell6孔板的上层和下层,普通高糖培养液共同培养;（3）诱导液培养组：将ADSCs接种于6孔板,用软骨诱导液进行培养.倒置显微镜观察各组ADSCs的形态变化,14d后行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化,实时荧光定量PCR测定软骨细胞相关基因（蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、SOX9）的表达情况.结果 细胞共培组和诱导液培养组ADSCs逐渐变为软骨样细胞形态,甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性,其中诱导液培养组染色更深,对照组为阴性.荧光定量PCR结果显示Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9的基因转录水平细胞共培组（1.427±0.066,2.128±0.076,1.082±0.081）和诱导液培养组（3.438±0.108,4.297±0.147,2.929±0.090）明显高于对照组（0.040±0.021,0.128±0.038,0.098±0.022） （P ＜0.05）,且诱导液培养组高于细胞共培组（P＜0.05）.结论 细胞共培法和诱导液培养法均可诱导ADSCs向软骨细胞定向分化,诱导液培养法诱导效果更好.

创面修复中外源性FN对NO的调节作用

目的:探讨外源性FN对内源性NO的调节作用,研究FN在加速感染创面修复中的作用机制。方法:家兔40只随机分成4组,FN组、中药组、FN+中药组和凡士林对照组,在家兔背部制各4cm直径感染创面模型,分别在术前和术后4、7、14、21d,采用改良的NO检测技术,测定血浆和创面渗出液中NO的动态变化。结果:创伤4d时,FN组、FN+中药组渗出液中NO水平高于其它各组(P<0.05),而14d时对照组NO水平升高最显著(P<0.05)。结论:提示FN可调控NO的分泌和释放,对促进感染创面的修复起重要作用。

超顺磁性氧化铁的合成及其对细胞标记相关研究进展

细胞移植在修复损伤组织等方面具有极大的前景。应用细胞治疗常规治疗效果不佳的疾病或建立更为优化的治疗方案，移植细胞的在体连续动态追踪显得尤为重要。超顺磁性氧化铁（SPIO）的应用，改善了以往只能依靠免疫组织化学、电镜等侵袭性方法的不便。研究者建立了多种制备该颗粒的方法，并摸索其标记细胞的最佳条件，通过动物实验，证实了SPIO活体示踪细胞的可行性及其优势，为细胞移植运用于临床治疗及疗效评价提供了可靠手段。

毛囊干细胞的分离及培养方法研究

目的建立一种分离效率高、创伤小的毛囊干细胞分离方法，筛选毛囊干细胞体外培养的最优条件，考察毛囊干细胞的体外增殖活性。方法获取兔胡须部皮肤全层，比较2种不同分离方法获得细胞的贴壁、增殖及克隆形成情况。通过免疫组化的方法检测毛囊干细胞β1整合素、CK19表达情况。选用MTT法和乳酸脱氢酶来间接反映毛囊干细胞的增殖能力。分析细胞周期考察细胞增殖过程中各期细胞的分布。观察血清浓度梯度条件培养液对毛囊干细胞增殖的影响。结果“两步酶”法的分离能获得大量细胞且细胞迅速贴壁，克隆迅速形成。获取的毛囊干细胞胞浆中有β1整合素、CK19的阳性表达。毛囊干细胞生长曲线及细胞周期都表明毛囊干细胞有高增殖能力。毛囊干细胞增殖表现出血清浓度的依赖。结论“两步酶”法是一种分离效率高、创伤小的方法，能够获取大量高表达β1整合素、CK19的毛囊干细胞。毛囊干细胞在适当条件下表现为高增殖能力，其生长有一定的血清依赖性。

兔坐骨神经匀浆上清液对脂肪干细胞的诱导分化作用

目的探讨兔坐骨神经匀浆上清液对脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）的诱导分化作用。方法取4月龄健康新西兰大白兔（体重2.0～2.5 kg）体外分离、培养ADSCs并传至第3代;用b FGF预诱导后,加入正常坐骨神经匀浆上清液（B组）及损伤3、7、14 d的坐骨神经匀浆上清液（分别为C、D、E组）对其进行诱导,空白对照组（A组）仅加入D-Hank液。观察细胞形态变化,并采用实时荧光定量PCR检测各组细胞神经组织蛋白（S-100）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）及巢蛋白（Nestin）基因表达,免疫细胞化学染色检测S-100蛋白表达。结果 C、D、E组细胞经诱导后逐渐出现雪旺细胞或神经细胞样形态改变,以D组变化最为明显;A、B组细胞形态未见明显改变,仍以梭形为主。S-100免疫细胞化学染色示,C、D、E组染色均为阳性,以D组阳性细胞最多;A、B组细胞无阳性表达。实时荧光定量PCR检测示,S-100基因表达量随损伤时间延长呈上升趋势,C、D组达高峰,之后缓慢下降;C、D组表达量显著高于A、B、E组（P〈0.05）,C、D组间差异无统计学意义（P〉0.05）。NSE基因表达量呈相同趋势,D组达高峰,之后缓慢下降;D、E组表达量显著高于A、B、C组（P〈0.05）,D、E组间差异亦有统计学意义（P〈0.05）。Nestin基因表达量各组间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论兔损伤坐骨神经匀浆上清液在体外能够有效诱导ADSCs分化为雪旺细胞和神经细胞,伤后早期（3～7 d）可作为细胞移植的最佳时间。

组织工程化皮肤的研制与应用

组织工程皮肤的研究发展迅速，目前已有许多组织工程化皮肤具有与正常皮肤相似的结构及屏障功能，应用于临床可达到理想愈合效果。根据人工表皮、无细胞活性的人工真皮替代物和有细胞活性的人工皮肤三大类，对组织工程皮肤的研制与应用进行介绍。